產品概述：
產品貨號：M7432S, M7432M
產品規格：20 rxns, 100 rxns
儲存條件：2-35℃下有效期為12個月。到貨后請將RNase A⑨放置于2-8℃或-20℃保存。
應用范圍：用于質粒的提取、富集、純化等步驟
產品組分
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組分 |
組分含量 |
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M7432S |
M7432M |
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A.溶液1（Buffer L1） |
5 mL 注:首次使用前加入I（0.1 mL RNase A） |
25mL 注:首次使用前加入I（0.5mL RNase A） |
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B.溶液2（Buffer L2） |
5 mL |
25 mL |
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C.溶液3（Buffer L3） |
7 mL |
35 mL |
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D.磁珠1（Beads 1） |
0.2 mL |
1 mL |
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E.結合液1（Buffer B1） |
3.5 mL |
17.5 mL |
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F.磁珠2（Beads 2） |
3 mL |
15 mL |
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G.洗滌液1（Buffer W1） |
6 mL 注：首次使用前加入6 mL異丙醇 |
30 mL 注：首次使用前加入30 mL異丙醇 |
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H. 洗脫液（BufferEB） |
2 mL |
10 mL |
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I. RNase A |
0.1 mL |
0.5mL |
產品介紹
本產品使用改進的SDS堿裂解法，采用雙磁珠法提取，避免高速離心或真空抽濾，可分別實現雜質的快速吸附去除以及質粒DNA的特異結合。含有質粒的待分離樣品經裂解后，利用磁珠與質粒特異性識別和高效結合，并利用磁性分離器或磁棒使磁珠吸附于管壁或磁棒套，通過洗滌、洗脫、純化過程得到所需的DNA。
適用儀器
本試劑盒適用于Thermo KingFisher Flex24等大體積自動化核酸提取儀，也適用于手動提取。
實驗步驟
一．首次使用前：
1.RNase A全部加入到溶液1（Buffer L1），并于“□”內打上“√”，混勻后2~8℃保存，有效期6個月。
2.在Buffer W1⑦中緩慢加入指定量的異丙醇（分析純，需客戶自備），并于“□”內打上“√”，混勻后2~35℃保存。
二．手動操作流程
1.客戶自備物品
（1）異丙醇（分析純）
（2）80%乙醇
（3）單通道移液器：20μL、200 μL、1000 μL
（4）恒溫金屬浴或水浴鍋
（5）漩渦振蕩器
（6）垂直混合儀
（7）2/15 mL磁性分離器、50 mL磁性分離器
2. 操作步驟
注意：不同樣本體積及其它試劑加樣量請參照表1要求！
1.手動提取（以1mL菌液提取為例）
1）富集菌體
收集1mL已培養12~16 h的菌液（OD600=2-3）于2mL離心管，12000 rpm離心1min，棄上清。加入250 μL Buffer L1（檢查是否已加入RNase A），振蕩至菌體徹底懸浮。
2）裂解菌體
向離心管中加入250 μL Buffer L2，蓋緊管蓋，立即溫和地上下顛倒混勻8-10次，室溫放置2min使菌體裂解充分，此時懸液會變得相對粘稠。
*注意：溫和的混勻，避免劇烈震蕩導致基因組斷裂
3）去除基因組和蛋白
3.1向離心管中加入350 μLBuffer L3，立即溫和地上下顛倒8-10次，充分混勻，溶液出現白色絮狀沉淀；
3.2 *將Beads 1懸液漩渦震蕩30 s，使磁珠充分震蕩重懸；向離心管中加入10 μL Beads 1，立即溫和地上下顛倒混勻8-10次；
3.3 *然后將離心管放在磁力架上，磁吸2分鐘使上清澄清，（若上清仍有渾濁，可再加入少量5-10μL Beads 1,上下顛倒混勻，再次磁吸）；
3.4取出上清加到新的1.5mL離心管中。
*注意：如離心更方便，可將3.2-3.3步省去，改用12000rpm離心10-15min去除沉淀。
4）結合質粒
4.1向上述1.5mL離心管中，加入175μL Buffer B1、150μL異丙醇和150μLBeads 2，漩渦震蕩10 s后，置于垂直混合儀上反應5min（或室溫靜置，每1分鐘振蕩混勻一次）；
4.2然后將離心管放在磁力架上2min，用移液器移去上清液并取下離心管。
5）洗滌
5.1 (可選步驟，若為endA+宿主菌，推薦此步)加入600 μLBuffer W1（檢查是否已加入異丙醇），以渦旋振蕩器最大轉速漩渦震蕩至少1min，使磁珠充分重懸，再將離心管置于磁性分離器上直至溶液澄清，移去上清液并取下離心管。
5.2加入600 μL 80%乙醇，以渦旋振蕩器最大轉速漩渦震蕩至少1 min，使磁珠充分重懸，將離心管置于磁性分離器上直至溶液澄清，移去上清液并取下離心管。重復該步驟一次，共洗滌2次。
*注意：最后一步洗滌應盡量除盡洗滌液。
6）干燥
保持離心管于磁性分離器上，于室溫下靜置5-10 min后，即磁珠表面無明顯光澤，取下離心管。
*注意：干燥過程中若發現反應管中有液體殘留時，可用小量程移液器吸棄液體。
7）洗脫
加入100 μL Buffer EB，渦旋震蕩，或用移液器緩慢吹打磁珠，使磁珠充分重懸。然后于50℃條件下孵育5min。
將離心管置于磁性分離器上直至溶液澄清，轉移上清液至新的1.5mL離心管中，此即為純化得到的質粒DNA，可進行后續實驗或保存于-20℃。
2.自動化提取
可以適配市面上大部分品牌核酸提取儀，詳細參數請聯系我司技術支持或設備廠商技術支持。
表1.手動操作不同樣本體積及其它試劑加樣量
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樣本體積 加入試劑 |
1-5 mL |
5-20 mL |
20-50 mL |
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Buffer L1 (已加入RNase A) |
250μL |
500μL |
1mL |
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Buffer L2 |
250μL |
500μL |
1mL |
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Buffer L3 |
350μL |
700μL |
1.4mL |
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Beads 1 |
10μL |
20μL |
40μL |
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Buffer B1 |
175μL |
350μL |
700μL |
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異丙醇 |
150μL |
300μL |
600μL |
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Beads 2 |
150μL |
300μL |
600μL |
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Buffer W1(可選) |
600μL |
1mL |
2mL |
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80%乙醇 |
600μL |
1mL |
2mL |
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Buffer EB |
100μL |
500μL |
1mL |
三．自動化操作流程
可以適配市面上大部分品牌核酸提取儀，詳細參數請聯系我司技術支持或設備廠商技術支持。
注意事項
1.操作之前，請務必認真閱讀本產品手冊。
2.到貨后請將RNase A放置于2-8℃或-20℃保存。首次使用前將RNase A全部加入到Buffer L1混勻，保存于2~8℃，有效期為6個月。
3.Beads 1和Beads 2的加入量與菌體量以及質粒拷貝數相關，可根據具體情況進行調整用量，磁珠取用前應充分重懸均勻。
4.使用自動化儀器進行Beads 1和沉淀的去除時，如儀器磁性較弱導致磁珠殘留，可適當增加0.5-1倍的Beads 1用量。Beads1過量可能會影響最終質粒得率。
5.去基因組和蛋白步驟，也可不使用Beads1，改為12000rpm離心10-15min。
6.應避免對磁珠進行冷凍、離心等操作。
7.磁珠干燥前，應使用移液器吸盡洗滌液。
8.應避免磁珠過度干燥，否則會嚴重降低核酸洗脫效率。
9.建議使用低吸附的離心管和移液器吸頭，避免因粘附磁珠而造成損失。
10.使用前請檢查各組分是否存在析出情況，如有析出，請將試劑瓶置于60℃水浴加熱溶解后使用。
11.本產品僅供科研使用。
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