2. 在洗滌液II中加入瓶身標簽指定量的無水乙醇（分析純），并于“□”內打上“√”，混勻。

3. 在蛋白酶K中加入瓶身標簽指定量的溶液A，并于“□”內打上“√”，混勻后保存于-20℃。

二．客戶自備物品

1.異丙醇（分析純）

2.1.5 mL離心管：RNase-free

3.單通道移液器：20 μL、200 μL、1000 μL

4.漩渦振蕩器

5.磁性分離器：可選用UE磁性分離器（貨號：M7429）。

注：每次使用前，試劑盒與樣本需平衡至室溫。

三．手動提取流程

1.準備DNase I反應液：取一個1.5 mL離心管，根據樣本數N，依次加入80×N μL的洗脫液 、10×N μL的10×Reaction Buffer、10×N μL的DNase I ，使用移液槍緩慢吸移20次或緩慢上下顛倒離心管20次混勻后待用。

注意：DNase I、DNase I反應液不可渦旋！

2.裂解：取新的1.5mL離心管，分別加入200 μL全血樣本（不足200 μL時可用PBS或生理鹽水補足），再分別加入400 μL裂解液和20 μL蛋白酶K，以渦旋振蕩器最大轉速渦旋震蕩2 min。

3.結合：在離心管內分別加入200 μL異丙醇和20 μL磁珠懸液，以渦旋振蕩器最大轉速渦旋震蕩2 min，室溫靜置15 min（間隔5 min渦旋震蕩30 s）。然后將離心管置于磁性分離器上放置1 min，用移液槍吸棄上清液并取下離心管。

4.洗滌

a. 在離心管內分別加入600 μL洗滌液I（檢查是否已加入異丙醇），以渦旋振蕩器最大轉速渦旋震蕩2 min，使磁珠充分重懸（如發現磁珠粘壁，可使用移液槍吸取管內的洗滌液Ⅰ反復吹打下管壁磁珠后再渦旋震蕩2 min），將離心管置于磁性分離器上直至溶液澄清，用移液槍吸棄上清液并取下離心管。

b.重復步驟a。

c.在離心管內分別加入600 μL洗滌液II（檢查是否已加入無水乙醇），以渦旋振蕩器最大轉速渦旋震蕩2 min，將離心管置于磁性分離器上直至溶液澄清，用移液槍吸棄上清液后室溫靜置3 min，取下離心管。

5. DNase I處理

a. 在離心管內分別加入100 μL DNase I反應液，使用移液槍吸取管內的DNase I反應液反復吹打下管壁磁珠，確認管壁上所有磁珠都被吹打入反應液后再緩慢吸移反應液20次使磁珠重懸。

b.室溫靜置15~30min。

6. 洗滌

a.在離心管內分別加入600 μL洗滌液II，以渦旋振蕩器最大轉速渦旋震蕩3 min，室溫靜置5 min。將離心管置于磁性分離器上直至溶液澄清，用移液槍吸棄上清液并取下離心管。

b.在離心管內分別加入600 μL洗滌液II，以渦旋振蕩器最大轉速渦旋震蕩2 min，將離心管置于磁性分離器上直至溶液澄清，用移液槍吸棄上清液。

7.干燥：保持離心管于磁性分離器上，室溫靜置5 min后，取下離心管。

注意：干燥過程中若發現反應管中有液體殘留時，可用小量程移液器吸棄液體。

8.洗脫：在離心管內分別加入50-100 μL洗脫液，以渦旋振蕩器最大轉速渦旋震蕩2 min，室溫靜置5 min。將離心管置于磁性分離器上直至溶液澄清，轉移上清液至新的離心管中，此即為純化得到的RNA，可保存于-70℃。

四．自動化提取流程

根據不同型號自動化核酸提取儀而定，詳情請咨詢我司技術支持或設備廠家技術支持。

注意事項

1.操作之前，請務必認真閱讀本產品手冊。

2.血液樣本的質量對產物RNA的完整性有較大影響，應使用新鮮抗凝處理的全血樣本，新鮮全血樣本可暫存于2~8℃，避免凍融，應及時處理。

3.應避免對磁珠進行冷凍、高速離心等操作。磁珠每次取用前應充分重懸均勻。

4.應避免磁珠過度干燥，否則會嚴重降低核酸洗脫效率。

5.應使用無RNase的離心管和槍頭。

6. 操作人員戴一次性口罩和手套，實驗過程中要勤換手套。

7. 本產品為一次性使用，使用后請按醫療垃圾進行處理。

8.使用前請檢查各組分是否存在析出情況，如有析出，請將試劑瓶置于60℃水浴加熱溶解后使用。