產(chǎn)品概述：
產(chǎn)品貨號：M7416S，M7416M，M7416L
產(chǎn)品規(guī)格：1 mL, 5 mg/mL,1 μm;5 mL, 5 mg/mL,1 μm; 100 mL, 5 mg/mL,1 μm
儲存條件：在2~8℃下保存，有效期見外包裝
產(chǎn)品介紹
OligoDT磁珠，分散性好，磁響應(yīng)快，親水性好。磁珠表面共價偶聯(lián)的OligoDT可與真核生物mRNA尾部的Poly A互補配對，可高效地從真核生物總RNA或直接從動植物組織或細胞裂解物中快速分離出完整、高純度的mRNA。分離得到的mRNA可用于多種分子生物學實驗：RT-PCR、固相cDNA文庫構(gòu)建、RACE、Northern等。產(chǎn)品信息見表1。
表1. Oligo DT磁珠信息
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產(chǎn)品信息 |
OligoDT磁珠（1 μm） |
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Oligo DT偶聯(lián)量 |
~ 500pmol/mg磁珠 |
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mRNA結(jié)合量 |
1-2 μg/mg磁珠 |
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磁珠濃度 |
5 mg/mL |
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保存溶液 |
1×PBS, 0.01% Tween-20, 0.1% proclin-300 |
實驗步驟
一．使用前準備
1.緩沖液：以下為常用的緩沖液成分，用戶可根據(jù)需要調(diào)整緩沖液配方，例如SSC等。
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結(jié)合緩沖液 |
10 mM Tris-HCl（pH 7.5）, 1.0 M NaCl, 1 mM EDTA |
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裂解/結(jié)合緩沖液 |
100 mM Tris-HCl（pH 7.5）, 500 mMNaCl, 10 mM EDTA, 1%SDS, 5 mM DTT |
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洗滌液I |
10 mM Tris-HCl（pH 7.5）, 0.15 MNaCl, 1 mM EDTA, 0.1%SDS |
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洗滌液II |
10 mM Tris-HCl（pH 7.5）, 0.15 MNaCl, 1 mM EDTA |
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洗脫液 |
Nuclease-Free Water |
注：所有試劑需用DEPC處理的純化水配制，使用時平衡至室溫，如有沉淀，可37℃預(yù)熱10 min。
2. RNase-free 1.5 mL離心管
3. 磁性分離器：可選用UElandy磁性分離器，貨號M7429
4. 漩渦振蕩器
5. 旋轉(zhuǎn)混合儀
6. 移液器及吸頭
二．清洗Oligo DT磁珠
1.將磁珠瓶置于漩渦振蕩器上20 s，振蕩充分重懸磁珠。用移液器移取所需體積的磁珠到新的離心管中。加入相同體積的結(jié)合緩沖液，重懸磁珠。
2.將離心管置于磁性分離器上，靜置1 min（此操作后續(xù)簡稱為磁性分離），用移液器吸去上清液，從磁性分離器上取下離心管。
3.加入初始體積相同體積的結(jié)合緩沖液，備用。
注：如從總RNA中純化mRNA，加入一半的初始體積，即磁珠濃縮至10 mg/mL。
三．從總RNA中純化mRNA
1.例如從100 μg總RNA中純化mRNA。用DEPC水將100 μg總RNA體積調(diào)整到100 μL。
2.加入相同體積的結(jié)合緩沖液（100 μL）。
3.65℃加熱2 min以打開二級結(jié)構(gòu)，然后迅速轉(zhuǎn)移至冰上。將200 μL總RNA溶液加入至100 μL洗滌后的磁珠。即每100 μg總RNA使用1 mg洗滌后且溶于100 μL結(jié)合緩沖液磁珠（步驟2），吹打混合均勻。
4.室溫，旋轉(zhuǎn)孵育10 min。
5.磁性分離1 min，小心移去上清。從磁性分離器上取下離心管。
6.加入200 μL洗滌液II，小心吹打混勻。
7.磁性分離1 min，小心移去上清。從磁性分離器上取下離心管。
8.重復(fù)洗滌一次（步驟6和7），共洗滌兩次。
注：洗滌需將磁珠徹底重懸，并第二次洗滌后盡量去除干凈上清。
9. 根據(jù)后續(xù)實驗，選擇下列其一：
（1）如不需要將mRNA從磁珠上洗脫下來，需用下游實驗的酶緩沖液再洗滌磁珠一次。
（2）如需從磁珠上洗脫mRNA：小心去除干凈洗滌緩沖液II（注意不要吸到磁珠），然后添加10~20 μL無酶水或10 mM Tris-HCl （pH 7.5），吹打充分混勻，室溫孵育2 min。然后將離心管放在磁力架上，將含有mRNA的上清液轉(zhuǎn)移至新的RNase-free的離心管中。
注：可65℃~75°C加熱洗脫，來提高洗脫效率。
四．從細胞裂物中分離mRNA
1.用PBS洗滌細胞懸液，離心獲得細胞沉淀。細胞沉淀可以立即使用，也可以在液氮中冷凍后儲存在-80℃?zhèn)溆谩?
2.向細胞沉淀（1~4×106細胞）中加入1 mL裂解/結(jié)合緩沖液。反復(fù)吹打幾次以確保裂解完全。裂解過程中釋放的DNA會導(dǎo)致溶液變粘，表明裂解完成。
3.通過DNA剪切步驟降低粘度。裂解液使用1-2 mL注射器通過21號針頭處理3次。反復(fù)剪切可能會導(dǎo)致裂解物起泡沫，但起泡不應(yīng)影響mRNA的產(chǎn)量。可以通過30s離心來減少泡沫。
4.裂解物可立即用于mRNA分離，或?qū)⑵淅鋬霾⒈４嬖讪C80℃?zhèn)溆谩?
5.將清洗過的Oligo DT磁珠，磁吸去除上清。加入裂解物，混合均勻。
6.室溫旋轉(zhuǎn)混合5 min進行結(jié)合。如果溶液粘稠，則增加結(jié)合時間。
7.將離心管放在磁力架上1-2 min，除去上清液。
8.磁珠清洗兩次：用1 mL洗滌液I洗滌一次，然后用1 mL洗滌液II洗滌一次。
注：洗滌需將磁珠徹底重懸，并在洗滌步驟之間完全去除上清。
9. 根據(jù)后續(xù)實驗，選擇下列其一：
（1）如果不需要將mRNA從磁珠上洗脫下來（如后續(xù)進行固相cDNA合成），請用洗滌液II（500 μL）再洗滌一次，然后用下游實驗中使用的酶緩沖液洗滌一次。
（2）從磁珠上洗脫mRNA：去除干凈洗滌液II，然后添加10~20 μL無酶水或10 mM的Tris-HCl（pH 7.5）。65°C~75°C孵育2 min，然后將離心管放在磁力架上，并迅速將含有mRNA的上清液轉(zhuǎn)移至新的RNase-free的離心管中。
注：根據(jù)mRNA的豐度，最終產(chǎn)量在不同組織/細胞之間可能會有所不同。一個哺乳動物細胞一般約有10~30 pg RNA，其中mRNA約占其中1~5%。
注意事項
1. 應(yīng)避免對磁珠進行冷凍等操作。
2. 為減少磁珠損失，每次磁性分離的時間應(yīng)不少于1 min。
3. 建議提取到的mRNA立即用于RT-PCR。如果需要保存，建議洗脫液中添加RNase抑制劑，將mRNA從磁珠上洗脫下來并且凍存。
4. 所有用于mRNA提取的buffer和耗材都應(yīng)該是RNase-free。
5. 從磁珠保存管中移取磁珠前應(yīng)充分震蕩重懸均勻。
6. 如果純化后的rRNA殘留量對下游應(yīng)用過高，可進行第二輪mRNA純化。
7. 建議使用質(zhì)量好的移液器吸頭和反應(yīng)管，避免因粘附磁珠及溶液而造成損失。
8. 本產(chǎn)品僅供研究使用。
說明書：
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