產(chǎn)品概述：
產(chǎn)品貨號：M7415S, M7415M, M7415L, M7415XL
產(chǎn)品規(guī)格：1 mL, 5 mL, 60 mL, 450 mL
儲存條件：在2~8℃下保存，有效期見外包裝
產(chǎn)品介紹
本品采用超順磁性微珠，配合優(yōu)化的緩沖液體系，在特定比例的磁珠懸液中，將不同分子量的核酸片段回收，整個(gè)操作過程方便快速，其回收的核酸片段可用于二代測序平臺的文庫構(gòu)建。本產(chǎn)品適合于回收150 bp~3000 bp長度的DNA，可手工實(shí)驗(yàn)操作，也可應(yīng)用在基于自動化移液工作站的高通量實(shí)驗(yàn)操作。
實(shí)驗(yàn)步驟
一．使用前準(zhǔn)備
1.80%(v/v)乙醇溶液（最好使用新鮮配置的）
2.10 mM Tris-HCl，pH 8.0
3.超純水
4.1 mM EDTA
5.漩渦振蕩器
6.磁性分離器：可選用UE磁性分離器，貨號：M7429
注：DNA樣本體積需≥50 μL。過小的體積會降低移液的準(zhǔn)確度，從而影響篩選范圍的準(zhǔn)確度。
二．操作步驟
提前半小時(shí)將DNA片段篩選試劑從4℃取出，使其溫度平衡至室溫。
1.左側(cè)片段篩選
用于回收分子量大于篩分界限的核酸片段，在該操作流程中，隨著磁珠懸液與樣本比率的增大，小片段核酸的結(jié)合效率會逐漸增大。
（1）結(jié)合：將50 μL樣本加入到合適的離心管中，再根據(jù)圖1加入特定體積的磁珠懸液，移液器吹打混勻10次或渦旋30 s，室溫靜置5 min；將離心管置于磁性分離器上至溶液變澄清，用移液器吸去上清。
注：樣本量×比率=磁珠懸液加入量，如50 μL樣本×0.6=30 μL磁珠懸液。
（2）洗滌：保持離心管于磁性分離器上，加入200 μL 80%乙醇，室溫靜置30 s后，用移液器吸去上清；重復(fù)該步驟一次。
注：最后一次洗滌后應(yīng)盡可能移除干凈洗滌液。
（3）干燥：保持離心管于磁性分離器上，風(fēng)干至磁珠表面無明顯光澤。
注：該步驟應(yīng)避免磁珠干燥過度而影響洗脫效率。表面有裂紋即代表干燥過度。
（4）洗脫：向離心管中加入30~40μL超純水、10 mM Tris-HCl或TE，用移液器反復(fù)吹打10次，使磁珠與溶液充分混勻
將反應(yīng)管于室溫靜置3~5 min。再將離心管置于磁性分離器至溶液變澄清，將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，可直接用于后續(xù)研究或者置于-20℃冰箱長期保存。
注：用戶可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要調(diào)整洗脫液體積，但不低于20 μL。
2.右側(cè)片段篩選
用于回收分子量小于篩分界限的核酸片段，在該操作流程中，隨著磁珠懸液與樣本比率的增大，大片段核酸的結(jié)合效率會逐漸降低，如圖1右側(cè)所示：
（1）一次結(jié)合：將50 μL樣本加入到合適的離心管中（編號A），再根據(jù)圖1加入特定體積的磁珠懸液，移液器吹打混勻10次或渦旋30 s，室溫靜置5 min；將離心管置于磁性分離器上至溶液變澄清，用移液器將上清轉(zhuǎn)移至另一個(gè)新的離心管中（編號B），棄去磁珠。
注：樣本量×比率=磁珠懸液加入量，如50 μL樣本×0.6=30 μL磁珠懸液。
（2）二次結(jié)合：在上述離心管B中加入指定量（見備注）的磁珠懸液，漩渦震蕩混勻后于室溫下靜置5min；將離心管置于磁性分離器上至溶液變澄清，用移液器吸去上清。
注：樣本量×(1.8-比率)=磁珠懸液加入量，如50 μL樣本×(1.8-0.6)=60 μL磁珠懸液。
（3）洗滌：保持離心管B于磁性分離器上，加入200 μL 80%乙醇，室溫下靜置30 s后，用移液器吸去上清；重復(fù)該步驟一次。
注：最后一次洗滌后應(yīng)盡可能除盡洗滌液。
（4）干燥：保持離心管B于磁性分離器上，風(fēng)干至磁珠表面無明顯光澤。
注：該步驟應(yīng)避免磁珠干燥過度而影響洗脫效率。
（5）洗脫：向離心管B中加入30~40μL超純水、10 mM Tris-HCl或TE，用移液器反復(fù)吹打10次，使磁珠與溶液充分混勻，將反應(yīng)管于室溫靜置3~5 min，再將離心管置于磁性分離器至溶液變澄清，將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，可直接用于后續(xù)研究或者置于-20℃冰箱長期保存。
注：用戶可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要調(diào)整洗脫液體積，但不低于20 μL
3.兩側(cè)片段篩選
用于回收分子量處于特定范圍的核酸片段，在該操作流程中，可通過調(diào)整磁珠懸液與樣本比率在左右兩側(cè)的變化（左側(cè)片段篩選比率總大于右側(cè)片段篩選比率），來控制反應(yīng)體系對某一范圍內(nèi)的核酸片段的回收。
（1）一次結(jié)合：將50 μL樣本加入合適的離心管（編號A）中，再根據(jù)圖1的右側(cè)片段篩選比率加入特定體積的磁珠懸液，漩渦震蕩混勻后于室溫下靜置5min；將離心管置于磁性分離器上至溶液變澄清，用移液器將上清轉(zhuǎn)移至另一個(gè)新的離心管中（編號B），棄去磁珠。
注：樣本量×右側(cè)片段篩選比率=磁珠懸液加入量，如50 μL樣本×0.60=30 μL磁珠懸液。
（2）二次結(jié)合：根據(jù)圖1的左側(cè)片段篩選比率，在上述離心管B中加入特定量（見注）的磁珠懸液，漩渦震蕩混勻后室溫下靜置5min；將離心管置于磁性分離器上至溶液澄清，用移液器吸去上清。
注：樣本量×(左側(cè)片段篩選比率-右側(cè)片段篩選比率)=磁珠懸液加入量，如50 μL樣本×(0.80-0.60)=10μL磁珠懸液。
（3）洗滌：保持離心管B于磁性分離器上，加入200 μL 80%(v/v)乙醇，室溫靜置30 s后，用移液器吸去上清；重復(fù)該步驟一次。
注：最后一次洗滌后應(yīng)盡可能除盡洗滌液。
（4）干燥：保持離心管B于磁性分離器上，風(fēng)干至磁珠表面無明顯光澤。
注：該步驟應(yīng)避免磁珠干燥過度而影響洗脫效率。
（5）洗脫：向離心管B中加入30~40μL超純水、10 mM Tris-HCl或TE，用移液器反復(fù)吹打10次，使磁珠與溶液充分混勻，將反應(yīng)管于室溫靜置3~5 min，再將離心管置于磁性分離器至溶液變澄清，將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，可直接用于后續(xù)研究或者置于-20℃冰箱長期保存。
注：用戶可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要調(diào)整洗脫液體積，但不低于20 μL。
圖1. DNA片段篩選結(jié)果
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注：圖左為左側(cè)片段篩選結(jié)果，圖右為右側(cè)片段篩選結(jié)果（樣本溶在TE中）
注意事項(xiàng)
1.操作之前，請務(wù)必認(rèn)真閱讀本產(chǎn)品說明書。
2.磁珠懸液在保存過程中應(yīng)避免冷凍、離心等操作。
3.建議使用質(zhì)量好的移液器吸頭和反應(yīng)管，避免因粘附磁珠及溶液而造成損失。
4.從磁珠保存管中移取磁珠前應(yīng)充分震蕩重懸均勻。
5.磁珠洗脫前應(yīng)徹底去除洗滌液，避免殘留乙醇影響DNA洗脫效率。
6.請勿長時(shí)間干燥磁珠，以免引起不可逆的磁珠聚集以及降低核酸洗脫效率。
7.樣品中含有其他鹽離子、PEG等成分，會影響最終片段篩選大小。如按建議篩選比率，需是不含影響篩選成分的，例如溶解在超純水、Tris、TE等。其他溶液，可根據(jù)具體情況進(jìn)行篩選比率的調(diào)整。
8.本產(chǎn)品僅供研究使用。
表1. 篩選的核酸片段大小與磁珠加入量的比率
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篩選片段平均大小 |
250 bp |
350 bp |
400 bp |
500 bp |
600 bp |
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磁珠用量 |
第一次 |
0.80× |
0.70× |
0.60× |
0.55× |
0.50× |
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第二次 |
0.20× |
0.20× |
0.20× |
0.15× |
0.15× |
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說明書：
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