產品貨號：M7414S,M7414M

產品規格：1 mL, 20%(v/v), 10-30 μm;5 mL, 20%(v/v), 10-30 μm

儲存條件：2~8℃保存，保質期見外包裝

產品介紹

本試劑盒表面為NHS基團修飾，能夠與帶有伯胺基團的蛋白和其他分子形成穩定的肽鍵，用于親和純化抗體、抗原和其他生物分子。與傳統的羧基、氨基磁珠相比，表面含NHS基團的磁珠無需事先采用EDC/NHS或戊二醛進行活化，只需簡單地將含伯氨基的生物配體溶解在試劑盒自帶的Coupling Buffer中，室溫下將蛋白與NHS磁珠混合1~2 h便可將生物配體共價偶聯到磁上，具有操作簡單、偶聯條件溫和、生物配體偶聯快速高效等優點。磁珠偶聯過程必需在不含任何氨基的緩沖溶劑中進行。人工操作時，使用磁性分離架實現磁珠與溶劑分離。也可采用自動化設備操作，自動化操作適合用于多樣品的篩選。本試劑盒組成見表1，磁珠的基本信息見表2。

表1. NHS瓊脂糖磁珠試劑盒組成

表2. NHS瓊脂糖磁珠基本信息

實驗步驟

一．蛋白溶液配制

1.取適量待偶聯蛋白用Coupling Buffer溶解，配成濃度為0.1-3.0 mg/mL的蛋白溶液。

2.已經保存于buffer中的蛋白，需要通過透析或者脫鹽的方法徹底除去原有buffer里含伯胺基的物質，然后再用Coupling Buffer配成濃度為0.1-3.0 mg/mL的蛋白溶液，將配制好的蛋白溶液于4oC保存備用。

注：（1）為了達到更好的性能，當蛋白濃度≥2 mg/mL時，此時偶聯效率會更高，不過需根據成本和使用要求綜合考慮；

（2）蛋白溶液中不能含有帶伯氨基的成分，比如Tris，甘氨酸，明膠，BSA等。

二．磁珠清洗

1.取500 μL磁珠于1.5 mL EP管中（磁珠取樣前要反復顛倒、使用渦旋振蕩器或者垂直混合儀使其混合均勻，以保證實驗的同一性）。

2.將EP管置于磁性分離架內，富集磁珠，去除上清液。

3.加1 mL 2~8oC的預冷的Wash Buffer A于1.5 mL EP管中，渦旋15 s，使磁珠混合均勻。

4.加1 mL 2~8oC的預冷的Wash Buffer A于1.5 mL EP管中，渦旋15 s，使磁珠混合均勻。

5.將EP管置于磁性分離架內，富集磁珠，去除上清液。

三．生物配體固定

1．加500 μL蛋白溶液于EP管中，渦旋30 s，使其混合均勻（磁珠洗滌后要立即加入蛋白溶液）。

2．將EP管渦旋15 s，置于垂直混合儀上，室溫混合1~2 h。如果垂直混合不均勻，則反應前30 min，每隔5 min取下EP管渦旋15 s。此后，每隔15 min，取下EP管渦旋15 s。（如有需要可以在4oC反應過夜）

3．采用磁性分離架富集磁珠，保存流穿液。

四．磁珠封閉

1.加1 mL Blocking Buffer于EP管中，渦旋30 s，將EP管置于磁性分離架內，富集磁珠，棄上清液（Blocking Buffer除了本試劑盒中提供的3 M乙醇胺外，也可以使用100 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 8.0等其它封端試劑）。

2.重復上述步驟操作四次。

3.加1 mL Blocking Buffer于EP管中，渦旋30 s，將EP管置于垂直混合儀中室溫反應2 h。

4.將EP管置于磁性分離架內，富集磁珠，棄上清液。

5.加1 mL超純水于EP管中，充分混合，用磁力架富集磁珠，棄上清液。

五．保存

1.加1 mL Storage Buffer（需客戶自備，比如含0.05%疊氮化鈉的PBS緩沖液，或者客戶根據自己實際需求選擇合適的保存溶液 ）于EP管中，充分混合，用磁力架富集磁珠，棄上清液。重復該操作2次。

2.加入500 μL Storage Buffer于EP管中，充分混合，4oC保存備用（最終偶聯蛋白后的磁珠濃度為10 mg/mL）。

蛋白偶聯操作流程圖及優化點

1.其中磁珠洗滌要嚴格按照說明書，采用的Washing Buffer A快速洗滌 ，以防磁珠在洗滌過程中NHS基團水解

2.蛋白偶聯過程中，首先要通過實驗確定合適的Coupling Buffer（主要包括Coupling Buffer A；Coupling Buffer B；50 mM硼酸溶液，pH8.5；100 mM磷酸緩沖液，100 mM NaCl，pH 7.4這四種）。

3.確定合適的Coupling Buffer后，再以此Coupling Buffer為基礎，確定合適的偶聯蛋白濃度，因為蛋白濃度越高，偶聯到磁珠上的蛋白的量會越大（這是由于NHS基團跟蛋白偶聯和NHS基團本身水解是一對競爭反應）。當然此處要綜合考慮使用性能和成本，有些客戶偶聯少量的蛋白便可滿足使用需求，這時采用低濃度的蛋白便可，這樣可以降低成本。

4.封閉這一步可以采用試劑盒中自帶的3 M乙醇胺，也可使用Tris緩沖液（100 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 8.0），封閉時間不得低于2 h，如果化學封閉后背景仍然很高，還可以額外加一步BSA封閉。

注意事項

1.磁珠對水分敏感。為了保證產品質量，在取樣之后需立即蓋上瓶蓋，并用封口膜密封，于4℃保存。

2.禁止將磁珠干燥或冷凍。干燥和冷凍操作可能導致磁珠的聚集從而喪失結合活性。

3.可通過間接法（e.g., Thermo Scientific® Pierce® 660 nm Protein Assay, Product No. 22660 and 22662）測定反應前后蛋白含量，或通過直接法（e.g., Thermo Scientific® Pierce® Micro BCA Protein Assay，Product No. 23235）檢測偶聯到磁珠表面的蛋白含量，使用280 nm附近的波長來測定蛋白含量是不可取的，因為NHS基團在280 nm波長附近有很強的吸收，會嚴重干擾檢測結果。

4.蛋白穩定劑（如BSA，gelatin）會抑制抗體與磁珠的結合，因此在磁珠偶聯抗體過程中，需要確保抗體保存體系中不存在含伯氨基的蛋白穩定劑。

5.緩沖液中含有帶伯胺的物質會抑制蛋白質偶聯到磁珠表面，去除伯胺物質可采用透析和脫鹽的方法。

6. NHS基團易水解，故在用Washing Buffer A洗滌時，一定要參照說明書進行。

7. 蛋白溶液要預先配制好，Washing Buffer A洗滌完畢后，要立即加入蛋白溶液進行偶聯反應。

8. 蛋白質和磁珠的偶聯效率因蛋白質種類和性質差異而不同。一般而言，蛋白質濃度為0.1~3.0 mg/mL時利于蛋白質偶聯；然而，對于不同的蛋白其濃度需要優化。