實驗步驟

緩沖液的準備

目標蛋白與組氨酸標簽蛋白純化磁珠的結合性能將直接影響目標蛋白的純化效率，而各種緩沖液配制也將在一定程度上影響目標蛋白的回收率和純度。因此，在較大規模蛋白純化之前，用戶應該自行設計實驗，篩選出適合純化目標蛋白的緩沖液體系，主要包括Binding Buffer、Washing Buffer、Elution Buffer。增加咪唑濃度進行洗脫是組氨酸標簽純化磁珠最常用的洗脫方法，首次使用時，在不確定最佳的洗脫咪唑濃度情況下，推薦在緩沖液中分別加入10 mM、20 mM、50 mM、100 mM、200 mM、300 mM、400 mM、500 mM咪唑，濃度從低到高分別洗脫，磁吸后收集蛋白上清液，之后通過SDS-PAGE電泳方法鑒定洗脫結果。以下提供的緩沖液體系適用于多數組氨酸標簽蛋白的純化，供用戶參考。

Binding Buffer：20 mM Phosphate Buffer，500 mM NaCl，5~50 mM Imidazole，pH7.4

Washing Buffer：20 mM Phosphate Buffer，500 mM NaCl，50~100 mM Imidazole，pH7.4

Elution Buffer： 20 mM Phosphate Buffer，500 mM NaCl，500 mM Imidazole，pH7.4

樣品處理

本說明書提供3種樣本處理方法

1. 大腸桿菌、酵母等細胞內表達蛋白：表達細胞用適量的Binding Buffer稀釋，加入蛋白酶抑制劑（如終濃度為1 mM的PMSF），重懸細胞，冰浴超聲裂解細胞，即為粗蛋白樣品。如果樣品過于粘稠，可根據需要在粗樣品中加入適量核酸酶，冰浴30 min，以降解核酸。另外，用戶也可以根據實際需要對蛋白樣品進行離心操作。

2. 胞外表達蛋白：取胞外表達上清，用等量Binding Buffer稀釋，即為粗蛋白樣品。

3. 動物細胞胞內表達蛋白：取適量動物細胞，先用適量PBS洗滌1次，棄上清；接著用適量含1%（V/V）Triton X-100或1%（V/V）NP-40的Binding Buffer重懸，加入蛋白酶抑制劑（如終濃度為1 mM的PMSF），冰浴10 min，即為粗蛋白樣品。

磁珠預處理

一般情況下，磁珠的使用量是由用戶根據目標蛋白產量和磁珠載量信息計算獲得。例如：采用大腸桿菌表達某目標蛋白，500 mL發酵液收獲2 g濕重的菌體，通過預實驗估算其目標蛋白產量為10~20 mg，用戶需要取5 mL磁珠懸液用于目標蛋白的純化。以下即以此為例進行詳細說明：

1. 磁珠置于漩渦混勻器上充分混勻，用移液器取5 mL磁珠懸液于15 mL離心管中，進行磁性分離*，棄上清液，從磁性分離器上取下離心管。

2. 加入5 mL Binding Buffer到上述裝有磁珠的離心管中，上下翻轉離心管數次，使磁珠重新懸浮；進行磁性分離，移去上清液。重復洗滌2次。

（注*：在磁性分離過程中，為了減少磁珠在使用過程中的損耗，待溶液變澄清后，蓋緊離心管蓋子，保持離心管仍在磁性分離器上，手持磁性分離器與離心管上下翻轉數次，使澄清的溶液涮洗離心管蓋上殘留的磁珠，靜置片刻，使溶液重新變澄清）

目標蛋白與磁珠結合

1. 用10 mL Binding Buffer懸浮2 g濕重的菌體，進行破碎和裂解之后，即為目標粗蛋白樣品，加入到裝有預處理磁珠的離心管中，將離心管置于漩渦混勻器振蕩15 s。

2. 將離心管置于旋轉混合儀上，室溫旋轉混合20~30 min（如果需要，可以在2~8℃ 的低溫環境下，旋轉混1 h，防止目標蛋白降解）。

3. 將離心管置于磁性分離器上進行磁性分離，移出上清液至新的離心管中以備后續檢測，從磁性分離器上取下離心管進行后續洗滌步驟。

磁珠洗滌

1. 加入10 mL Washing Buffer到裝有磁珠的離心管中，輕輕翻轉離心管數次，使磁珠重新懸浮，磁性分離，移出清洗液到新的離心管中，以備取樣檢測。重復此步驟1次。

2. 加入10 mL Washing Buffer到裝有磁珠的離心管，使磁珠重新懸浮，將磁珠懸液轉移到新的離心管（避免原離心管壁上非特異性吸附蛋白污染目標蛋白），磁性分離，移出上清液到清洗液收集管。

目標蛋白洗脫

1. 用戶可根據需要改變洗脫體積調整目標蛋白濃度，加入2~10 mL Elution Buffer，輕輕翻轉離心管數次，使磁珠懸浮，磁性分離，收集洗脫液到新的離心管中，即為純化的目標蛋白樣品。

2. 如果需要，可以重復上述步驟1次，收集樣品到新的離心管中，以檢測目標蛋白是否洗脫完全。

磁珠后處理

1. 在裝有磁珠的離心管中加入5 mL Elution Buffer，上下翻轉離心管數次，使磁珠懸浮，磁性分離，去除上清液。

2. 重復上述步驟2次。

3. 在離心管中加入5 mL ddH2O，上下翻轉離心管數次，使磁珠懸浮，磁性分離，去除上清液。

4. 重復上述步驟2次。

5. 加入Storage Buffer到磁珠中使總體積為5 mL，保存于2~30℃（長期保存，置于2~8℃），可用于下一次同種蛋白的純化。

磁珠再生

磁珠連續使用三次以上，其結合目標蛋白的能力可能會明顯降低，建議進行磁珠再生處理。

Stripping Buffer：20 mM Sodium Phosphate，500 mM NaCl，100 mM EDTA，pH 7.4

Beads Washing Buffer（可選）：0.5 M NaOH，2 M NaCl

Recharge Buffer：100 mM NiSO4 / CoCl2 （該化學試劑有一定的毒性，可能造成過敏反應，使用時務必注意）

Storage Buffer：20%（V/V）乙醇

以5 mL 10%（V/V）磁珠懸液為例，詳細說明磁珠再生操作：

1. 將磁珠懸液進行磁性分離，去除上清液，從磁性分離器上取下離心管，在離心管中加入5 mL ddH2O， 上下翻轉離心管數次，使磁珠重新懸浮，磁性分離，去除上清液。

2. 加入5 mL Stripping Buffer，上下翻轉離心管數次，使磁珠重新懸浮，室溫旋轉混合5 min，磁性分離，去除上清液。重復此步驟1次。

3. 加入5 mL ddH2O，上下翻轉離心管數次，使磁珠重新懸浮，磁性分離，去除上清液，重復此步驟 2次。

4. 堿處理：加入5 mL Beads Washing Buffer，上下翻轉離心管數次，使磁珠重新懸浮，室溫旋轉混合5 min，磁性分離，去除上清液。加入5 mL ddH2O，上下翻轉離心管數次，使磁珠重新懸浮，磁性分離，去除上清液。重復 ddH2O洗滌步驟3~5次，至洗滌液呈中性為止。

5. 加入5 mL Recharge Buffer，上下翻轉離心管數次，使磁珠重新懸浮，室溫旋轉混合20 min，磁性分離，去除上清液。

6. 加入5 mL ddH2O，上下翻轉離心管數次，使磁珠重新懸浮，磁性分離，去除上清液。重復此步驟4次以上，保證鎳離子去除完全。

7. 加入Storage Buffer到磁珠中使總體積為5 mL，保存于2~30℃（長期保存，置于2~8℃）。

蛋白純化流程的優化

以上操作流程適用于大部分組氨酸標簽蛋白的純化，根據目標蛋白與金屬離子螯合磁珠的結合性能不同，用戶可以從以下幾個方面對純化流程進行優化，以提高目標蛋白的回收率和純度。

提高目標蛋白回收率的參考方法：

1. 降低樣品溶液和Binding Buffer中的Imidazole濃度；

2. 樣品溶液和其它緩沖液中添加表面活性劑等物質；

3. 添加合適的蛋白酶抑制劑，防止目標蛋白降解；

4. 增加磁珠用量；

5. 延長蛋白與磁珠孵育的時間；

6. 延長洗脫目標蛋白的時間或增加洗脫次數。

提高目標蛋白純度的參考方法：

1. 提高樣品溶液和Binding Buffer中Imidazole、NaCl的濃度；

2. 樣品和緩沖液中添加表面活性劑等物質；

3. 添加合適的蛋白酶抑制劑，防止目標蛋白降解；

4. 延長洗滌的時間，增加洗滌次數；

5. 采用梯度Imidazole濃度洗脫目標蛋白。

注意事項

1. 首次使用本產品前，請務必詳細閱讀本用戶手冊；

2. 磁珠使用和保存過程中應避免冷凍、干燥和高速離心等操作；

3. 在使用本產品前，請務必充分振蕩使磁珠保持均勻的懸浮狀態；

4. 請選用質量好的移液器吸頭和離心管，以免磁珠貼壁或混合過程發生滲漏引起磁珠的損耗；

5. 磁珠與溶液混合過程中，如果溶液粘稠無法通過翻轉離心管重懸磁珠，可采用移液器反復吹吸或短時漩渦混合使磁珠充分重懸；

6. 用戶可根據實際需要保留經磁性分離移去的上清液，進行取樣檢測，以便分析純化過程和優化蛋白純化流程；

7. 本產品可以重復使用，當純化性能降低時，建議進行再生處理；

8. 使用過的磁珠重復使用時，建議純化同種蛋白，純化不同種類的蛋白時，建議使用新的磁珠；

9. 本產品需與磁性分離器配套使用；

10. 本產品僅供研究使用。

磁珠的溶劑耐受性