產品概述：
儲存條件：2~8℃保存，有效期見外包裝
應用范圍：谷胱甘肽巰基轉移酶（GST）融合蛋白、谷胱甘肽轉移酶以及與谷胱甘肽有親和作用的其它蛋白的分離純化
產品介紹
UE GST融合蛋白純化磁珠是專為高效、快速純化谷胱甘肽巰基轉移酶（GST）融合蛋白而設計的一種新型功能化材料，可通過磁性分離方式直接從生物樣品中一步純化出高純度的目標蛋白，極大地簡化純化工藝和提高純化效率，適合科研和工業領域便捷地進行GST融合蛋白的純化。
與傳統的柱層析純化方式相比，采用UE磁珠純化GST融合蛋白，無需對粗蛋白樣品進行多次長時間的高速離心及濾膜過濾、無需控制流速、更不需要昂貴的層析設備。樣品與磁珠的特異性結合、洗滌及目標蛋白洗脫變得非常簡單、快速、易操作。對于熟練的操作者而言，在1 h內就能獲得高純度的目的蛋白，且能輕松實現高通量和大規模樣品的平行處理，為研究者節省了時間和成本。磁珠的基本信息見表1。
表1. 磁珠基本信息
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磁珠粒徑 |
30 μm~150 μm |
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GSH配基含量 |
20~30 μmol/mL（100%磁珠） |
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GST融合蛋白結合量1 |
≥5 mg/mL（100%磁珠） |
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懸液濃度2 |
10%（V/V）磁珠懸液 |
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保存液 |
20%（V/V）乙醇 |
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化學穩定性 |
常溫 可耐受70%乙醇、6 M鹽酸胍、0.1 M氫氧化鈉、0.1 M醋酸1 h |
注1：磁珠蛋白結合量與目標蛋白特性相關，此處僅做參考值。
注2：1 mL磁珠懸液中含有100 μL磁珠
實驗步驟
目標蛋白與磁珠的結合性能將直接影響目標蛋白的純化效率，各種緩沖液配制也將在一定程度上影響目標蛋白的回收率和純度。因此，在較大規模蛋白純化之前，用戶應該自行設計實驗，篩選出適合目標蛋白的緩沖液，包括Binding/Washing Buffer（Buffer A）及Elution Buffer（Buffer B）。以下提供一個較強結合力的GST標簽蛋白的純化流程，供用戶參考。
一．緩沖溶液配制
Buffer A：140 mM NaCl，2.7 mM KCl，10 mM Na2HPO4，1.8 mM KH2PO4，pH 7.4
Buffer B：50 mM Tris-HCl，10 mM還原型谷胱甘肽，pH 8.0配制方法：0.1 M Tris溶液50 mL，0.307 g還原型谷胱甘肽，然后用0.1 M鹽酸調pH到8.0，加去離子水至100 mL。
注：可等比例放大縮小。
注：（1）還原型谷胱甘肽容易被氧化，Buffer B要求現配現用（請按需溶解，防止氧化，請勿一次性全部溶解）；
（2）不同的GST融合蛋白與磁珠結合的強弱程度不同，對大部分的GST融合蛋白，使用含有10 mM還原性谷胱甘肽的Buffer B即可洗脫目標蛋白；對少數結合能力較強的GST融合蛋白，可以適當延長洗脫時間，增加洗脫次數，或提高Buffer B中還原型谷胱甘肽的濃度；
（3）Buffer A和Buffer B中可以添加1~5 mM EDTA、1~10 mM DTT、0.1~1.0% Triton X-100、0.1~1.0% Tween 20等，以提高目標蛋白的穩定性。
二．樣品處理
本說明書提供以下三種樣品的處理方法：
1. 大腸桿菌、酵母等細胞內表達蛋白：表達細胞用適量Buffer A稀釋，加入蛋白酶抑制劑（如終濃度為1 mM的PMSF）；冰浴超聲裂解細胞，即為粗蛋白樣品。如果樣品過于粘稠，可根據需要在粗樣品中加入適量核酸酶，在冰上放置30 min，以降解核酸。另外，如果目標蛋白含量較低，建議將粗蛋白樣品進行離心操作。
2. 胞外表達蛋白：取胞外表達上清，用等量Buffer A稀釋平衡，即為粗蛋白樣品。
3. 動物細胞胞內表達蛋白：取適量動物細胞，用適量PBS洗滌1次，棄上清；用適量含1%（V/V）Triton X-100或1%（V/V）NP-40的Buffer A重懸；加入蛋白酶抑制劑（如終濃度為1 mM的PMSF）；置于冰上10 min，即為粗蛋白樣品。
三．磁珠預處理
一般情況下，磁珠的使用量是由用戶根據目標蛋白產量和磁珠載量信息計算獲得。例如：采用大腸桿菌表達某目標蛋白，250 mL發酵液收獲1 g濕重的菌體，通過預實驗估算其目標蛋白產量為5~10 mg，用戶需要取10 mL 10%的磁珠懸液用于目標蛋白的純化。以下即以此為例進行詳細說明：
1. 將UE磁珠產品置于漩渦混勻器上充分混勻，用移液器取10 mL磁珠懸液于離心管中；
2. 將離心管置于磁性分離器上，待溶液變澄清后，移去上清液；
加入5~10 mL Buffer A到上述裝有磁珠的離心管中，蓋緊蓋子，漩渦振蕩15 s，使磁珠重新懸浮。將離心管置于磁性分離器上，磁性分離，移去上清液，重復洗滌2次。
注：在磁性分離過程中，為了減少磁珠在使用過程中的損耗，待溶液變澄清后，蓋緊離心管蓋子，保持離心管仍在磁性分離器上，手持磁性分離器與離心管上下翻轉數次，使澄清的溶液涮洗離心管蓋上殘留的磁珠，靜置片刻，使溶液重新變澄清。
四．目標蛋白與磁珠結合
1.用10 mL Buffer A懸浮1 g濕重的菌體，進行破碎和裂解后，即為粗蛋白樣品；
2.將粗蛋白樣品加入到裝有預處理磁珠的離心管中，蓋緊離心管蓋；
3.將離心管置于漩渦混勻器振蕩15 s，然后置于旋轉混合儀上，室溫旋轉混合20~30 min（如果需要，可在2~8℃的低溫環境下旋轉混合約1 h，防止目標蛋白降解）；
4.將離心管置于磁性分離器上進行磁性分離，移出上清液到新的離心管中以備后續檢測。從磁性分離器上取下離心管進行后續洗滌步驟。
五．磁珠洗滌
1.加入5~10 mL Buffer A到裝有磁珠的離心管中，旋轉混合2 min，磁性分離，移出清洗液到新的離心管中，以備取樣檢測；
2.加入5~10 mL Buffer A到裝有磁珠的離心管，使磁珠重新懸浮，將磁珠懸液轉移至新的離心管，避免原離心管壁上非特異性吸附蛋白污染目標蛋白；磁性分離，移出上清液到清洗液收集管。
六．目標蛋白洗脫
1.加入2~5 mL Buffer B（用戶可根據需要改變洗脫體積調整目標蛋白濃度）于離心管中，蓋緊離心管蓋，然后將離心管置于旋轉混合儀上，室溫旋轉混合2 min；磁性分離，收集洗脫液到新的離心管中，即為純化的目標蛋白樣品；
2.如果需要，可以重復上述步驟1次，收集樣品到新的離心管中，以檢測目標蛋白是否洗脫完全。
七．磁珠清洗和保存
磁珠使用后經過簡單清洗處理后，可以繼續用于后續的純化操作，也可以長時間保存。用戶可根據磁珠使用的情況選擇不同的清洗方法，主要有以下幾種情況：
1. 重復使用次數較少，結合能力下降不明顯時，可以采用高pH和低pH buffer交替洗滌的方式進行清洗。
（1）高pH洗（堿洗）：使用后的磁珠加入10 mL Buffer C（即0.1 M Tris-HCl，0.5 M NaCl，pH 8.5），漩渦振蕩60 s，磁性分離，去除上清液一；
（2）低pH洗（酸洗）加入10 mL Buffer D（即0.1 M醋酸鈉，0.5 M NaCl，pH 4.5），漩渦振蕩60 s，磁性分離，去除上清液；
（3）重復堿洗、酸洗交替清洗2次，共3次。
2.重復使用次數較多時，由于沉淀、變性或非特異性吸附蛋白積累，導致磁珠結合目標蛋白的能力明顯下降。去除沉淀或變性蛋白，可按下面的方法進行洗滌：
（1）先用5 mL 6 M鹽酸胍洗滌2次，每次漩渦振蕩60 s，磁性分離，去除上清液；
（2）再用10 mL 1×PBS洗滌3次，每次漩渦振蕩60 s，磁性分離，去除上清液。
3.去除疏水性結合物質，可按下面的方法進行洗滌：
（1）先用5 mL 70%乙醇或濃度為0.1%的非離子型表面活性劑洗滌3次，每次漩渦振蕩60 s，磁性分離，去除上清液；
（2）再用10 mL 1×PBS洗滌3次，每次漩渦振蕩60 s，磁性分離，去除上清液。
注：完成情況1或情況2的清洗操作后，如果用戶需要繼續使用磁珠用于蛋白純化，需先用Buffer A洗滌2~3次。如果不需要繼續使用，則用20%乙醇洗滌磁珠2~3次后，再加入20%（V/V）乙醇到磁珠中使總體積為10 mL，保存于2~8°C。
蛋白純化流程的優化
以上操作流程適用于大部分GST融合蛋白的純化，根據目標蛋白與GST融合蛋白純化磁珠的結合性能不同，用戶可以從以下幾個方面對純化流程進行優化，以提高目標蛋白的回收率和純度。
1. 提高目標蛋白回收率的參考方法：
（1）延長蛋白溶液與磁珠孵育的時間；
（2）樣品及緩沖液中加入1~10 mM的DTT，有助于提高部分GST融合蛋白與磁珠的結合；
（3）添加合適的蛋白酶抑制劑，防止目標蛋白降解；
（4）增加磁珠用量；
（5）延長洗脫目標蛋白的時間或增加洗脫次數；
（6）使用新鮮配制的Buffer B保證目標蛋白洗脫效率。
2.提高目標蛋白純度的參考方法：
（1）避免劇烈的超聲破碎造成GST標簽與目標蛋白發生斷裂；
（2）在純化過程中添加合適的蛋白酶抑制劑，防止目標蛋白降解；
（3）在樣品溶液和緩沖液中加入0.1%的Tween20或2%的NP-40可降低非特異蛋白的吸附；
（4）延長洗滌時間，增加洗滌次數；
（5）采用梯度濃度還原型谷胱甘肽洗脫目標蛋白。
注意事項
1.首次使用本產品前，請務必詳細閱讀本用戶手冊；
2.磁珠使用和保存過程中應避免冷凍、干燥和高速離心等操作；
3.在使用本產品前，請務必充分振蕩使磁珠保持均勻的懸浮狀態；
4.請選用質量好的移液器吸頭和離心管，以免磁珠貼壁或混合過程發生滲漏引起磁珠的損耗；
5.磁珠與溶液混合過程中，如果溶液粘稠無法通過翻轉離心管重懸磁珠，可采用移液器反復吹吸或短時漩渦混合使磁珠充分重懸；
6.用戶可根據實際需要保留經磁性分離移去的上清液，進行取樣檢測，以便分析純化過程和優化蛋白純化流程；
7.本產品可以重復使用，重復使用時，建議純化同種蛋白，純化不同種類的蛋白時，建議使用新的磁珠，以防交叉污染；
8.本產品需與磁性分離器配套使用；
9.本產品僅供研究使用。
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