實(shí)驗(yàn)步驟

目標(biāo)蛋白與磁珠的結(jié)合性能將直接影響目標(biāo)蛋白的純化效率，各種緩沖液配制也將在一定程度上影響目標(biāo)蛋白的回收率和純度。因此，在較大規(guī)模蛋白純化之前，用戶應(yīng)該自行設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，篩選出適合目標(biāo)蛋白的緩沖液，包括Binding/Washing Buffer（Buffer A）及Elution Buffer（Buffer B）。以下提供一個較強(qiáng)結(jié)合力的GST標(biāo)簽蛋白的純化流程，供用戶參考。

一．緩沖溶液配制

Buffer A：140 mM NaCl，2.7 mM KCl，10 mM Na2HPO4，1.8 mM KH2PO4，pH 7.4

Buffer B：50 mM Tris-HCl，10 mM還原型谷胱甘肽，pH 8.0配制方法：0.1 M Tris溶液50 mL，0.307 g還原型谷胱甘肽，然后用0.1 M鹽酸調(diào)pH到8.0，加去離子水至100 mL。

注：可等比例放大縮小。

注：（1）還原型谷胱甘肽容易被氧化，Buffer B要求現(xiàn)配現(xiàn)用（請按需溶解，防止氧化，請勿一次性全部溶解）；

（2）不同的GST融合蛋白與磁珠結(jié)合的強(qiáng)弱程度不同，對大部分的GST融合蛋白，使用含有10 mM還原性谷胱甘肽的Buffer B即可洗脫目標(biāo)蛋白；對少數(shù)結(jié)合能力較強(qiáng)的GST融合蛋白，可以適當(dāng)延長洗脫時間，增加洗脫次數(shù)，或提高Buffer B中還原型谷胱甘肽的濃度；

（3）Buffer A和Buffer B中可以添加1~5 mM EDTA、1~10 mM DTT、0.1~1.0% Triton X-100、0.1~1.0% Tween 20等，以提高目標(biāo)蛋白的穩(wěn)定性。

二．樣品處理

本說明書提供以下三種樣品的處理方法：

1. 大腸桿菌、酵母等細(xì)胞內(nèi)表達(dá)蛋白：表達(dá)細(xì)胞用適量Buffer A稀釋，加入蛋白酶抑制劑（如終濃度為1 mM的PMSF）；冰浴超聲裂解細(xì)胞，即為粗蛋白樣品。如果樣品過于粘稠，可根據(jù)需要在粗樣品中加入適量核酸酶，在冰上放置30 min，以降解核酸。另外，如果目標(biāo)蛋白含量較低，建議將粗蛋白樣品進(jìn)行離心操作。

2. 胞外表達(dá)蛋白：取胞外表達(dá)上清，用等量Buffer A稀釋平衡，即為粗蛋白樣品。

3.動物細(xì)胞胞內(nèi)表達(dá)蛋白：取適量動物細(xì)胞，用適量PBS洗滌1次，棄上清；用適量含1%（V/V）Triton X-100或1%（V/V）NP-40的Buffer A重懸；加入蛋白酶抑制劑（如終濃度為1 mM的PMSF）；置于冰上10 min，即為粗蛋白樣品。

三．磁珠預(yù)處理

一般情況下，磁珠的使用量是由用戶根據(jù)目標(biāo)蛋白產(chǎn)量和磁珠載量信息計(jì)算獲得。例如：采用大腸桿菌表達(dá)某目標(biāo)蛋白，250 mL發(fā)酵液收獲1 g濕重的菌體，通過預(yù)實(shí)驗(yàn)估算其目標(biāo)蛋白產(chǎn)量為5~10 mg，用戶需要取10 mL 10%的磁珠懸液用于目標(biāo)蛋白的純化。以下即以此為例進(jìn)行詳細(xì)說明：

1. 將UE磁珠產(chǎn)品置于漩渦混勻器上充分混勻，用移液器取10 mL磁珠懸液于離心管中；

2. 將離心管置于磁性分離器上，待溶液變澄清后，移去上清液；

3. 加入5~10 mL Buffer A到上述裝有磁珠的離心管中，蓋緊蓋子，漩渦振蕩15 s，使磁珠重新懸浮。將離心管置于磁性分離器上，磁性分離，移去上清液，重復(fù)洗滌2次。

注：在磁性分離過程中，為了減少磁珠在使用過程中的損耗，待溶液變澄清后，蓋緊離心管蓋子，保持離心管仍在磁性分離器上，手持磁性分離器與離心管上下翻轉(zhuǎn)數(shù)次，使澄清的溶液涮洗離心管蓋上殘留的磁珠，靜置片刻，使溶液重新變澄清。

四．目標(biāo)蛋白與磁珠結(jié)合

1.用10 mL Buffer A懸浮1 g濕重的菌體，進(jìn)行破碎和裂解后，即為粗蛋白樣品；

2.將粗蛋白樣品加入到裝有預(yù)處理磁珠的離心管中，蓋緊離心管蓋；

3.將離心管置于漩渦混勻器振蕩15 s，然后置于旋轉(zhuǎn)混合儀上，室溫旋轉(zhuǎn)混合20~30 min（如果需要，可在2~8℃的低溫環(huán)境下旋轉(zhuǎn)混合約1 h，防止目標(biāo)蛋白降解）；

4.將離心管置于磁性分離器上進(jìn)行磁性分離，移出上清液到新的離心管中以備后續(xù)檢測。從磁性分離器上取下離心管進(jìn)行后續(xù)洗滌步驟。

五．磁珠洗滌

1.加入5~10 mL Buffer A到裝有磁珠的離心管中，旋轉(zhuǎn)混合2 min，磁性分離，移出清洗液到新的離心管中，以備取樣檢測；

2.加入5~10 mL Buffer A到裝有磁珠的離心管，使磁珠重新懸浮，將磁珠懸液轉(zhuǎn)移至新的離心管，避免原離心管壁上非特異性吸附蛋白污染目標(biāo)蛋白；磁性分離，移出上清液到清洗液收集管。

六．目標(biāo)蛋白洗脫

1.加入2~5 mL Buffer B（用戶可根據(jù)需要改變洗脫體積調(diào)整目標(biāo)蛋白濃度）于離心管中，蓋緊離心管蓋，然后將離心管置于旋轉(zhuǎn)混合儀上，室溫旋轉(zhuǎn)混合2 min；磁性分離，收集洗脫液到新的離心管中，即為純化的目標(biāo)蛋白樣品；

2.如果需要，可以重復(fù)上述步驟1次，收集樣品到新的離心管中，以檢測目標(biāo)蛋白是否洗脫完全。

七．磁珠清洗和保存

磁珠使用后經(jīng)過簡單清洗處理后，可以繼續(xù)用于后續(xù)的純化操作，也可以長時間保存。用戶可根據(jù)磁珠使用的情況選擇不同的清洗方法，主要有以下幾種情況：

1. 重復(fù)使用次數(shù)較少，結(jié)合能力下降不明顯時，可以采用高pH和低pH buffer交替洗滌的方式進(jìn)行清洗。

（1）高pH洗（堿洗）：使用后的磁珠加入10 mL Buffer C（即0.1 M Tris-HCl，0.5 M NaCl，pH 8.5），漩渦振蕩60 s，磁性分離，去除上清液一；

（2）低pH洗（酸洗）加入10 mL Buffer D（即0.1 M醋酸鈉，0.5 M NaCl，pH 4.5），漩渦振蕩60 s，磁性分離，去除上清液；

（3）重復(fù)堿洗、酸洗交替清洗2次，共3次。

2. 重復(fù)使用次數(shù)較多時，由于沉淀、變性或非特異性吸附蛋白積累，導(dǎo)致磁珠結(jié)合目標(biāo)蛋白的能力明顯下降。去除沉淀或變性蛋白，可按下面的方法進(jìn)行洗滌：

（1）先用5 mL 6 M鹽酸胍洗滌2次，每次漩渦振蕩60 s，磁性分離，去除上清液；

（2）再用10 mL 1×PBS洗滌3次，每次漩渦振蕩60 s，磁性分離，去除上清液。

3.去除疏水性結(jié)合物質(zhì)，可按下面的方法進(jìn)行洗滌：

（1）先用5 mL 70%乙醇或濃度為0.1%的非離子型表面活性劑洗滌3次，每次漩渦振蕩60 s，磁性分離，去除上清液；

（2）再用10 mL 1×PBS洗滌3次，每次漩渦振蕩60 s，磁性分離，去除上清液。

注：完成情況1或情況2的清洗操作后，如果用戶需要繼續(xù)使用磁珠用于蛋白純化，需先用Buffer A洗滌2~3次。 如果不需要繼續(xù)使用，則用20%乙醇洗滌磁珠2~3次后，再加入20%（V/V）乙醇到磁珠中使總體積為10 mL，保存于2~8°C。

蛋白純化流程的優(yōu)化

以上操作流程適用于大部分GST融合蛋白的純化，根據(jù)目標(biāo)蛋白與GST融合蛋白純化磁珠的結(jié)合性能不同，用戶可以從以下幾個方面對純化流程進(jìn)行優(yōu)化，以提高目標(biāo)蛋白的回收率和純度。

1.  提高目標(biāo)蛋白回收率的參考方法：

（1）延長蛋白溶液與磁珠孵育的時間；

（2）樣品及緩沖液中加入1~10 mM的DTT，有助于提高部分GST融合蛋白與磁珠的結(jié)合；

（3）添加合適的蛋白酶抑制劑，防止目標(biāo)蛋白降解；

（4）增加磁珠用量；

（5）延長洗脫目標(biāo)蛋白的時間或增加洗脫次數(shù)；

（6）使用新鮮配制的Buffer B保證目標(biāo)蛋白洗脫效率。

2.提高目標(biāo)蛋白純度的參考方法：

（1）避免劇烈的超聲破碎造成GST標(biāo)簽與目標(biāo)蛋白發(fā)生斷裂；

（2）在純化過程中添加合適的蛋白酶抑制劑，防止目標(biāo)蛋白降解；

（3）在樣品溶液和緩沖液中加入0.1%的Tween20或2%的NP-40可降低非特異蛋白的吸附；

（4）延長洗滌時間，增加洗滌次數(shù)；

（5）采用梯度濃度還原型谷胱甘肽洗脫目標(biāo)蛋白。

注意事項(xiàng)

1.首次使用本產(chǎn)品前，請務(wù)必詳細(xì)閱讀本用戶手冊；

2.磁珠使用和保存過程中應(yīng)避免冷凍、干燥和高速離心等操作；

3.在使用本產(chǎn)品前，請務(wù)必充分振蕩使磁珠保持均勻的懸浮狀態(tài)；

4.請選用質(zhì)量好的移液器吸頭和離心管，以免磁珠貼壁或混合過程發(fā)生滲漏引起磁珠的損耗；

5.磁珠與溶液混合過程中，如果溶液粘稠無法通過翻轉(zhuǎn)離心管重懸磁珠，可采用移液器反復(fù)吹吸或短時漩渦混合使磁珠充分重懸；

6.用戶可根據(jù)實(shí)際需要保留經(jīng)磁性分離移去的上清液，進(jìn)行取樣檢測，以便分析純化過程和優(yōu)化蛋白純化流程；

7.本產(chǎn)品可以重復(fù)使用，重復(fù)使用時，建議純化同種蛋白，純化不同種類的蛋白時，建議使用新的磁珠，以防交叉污染；

8.本產(chǎn)品需與磁性分離器配套使用；

9.本產(chǎn)品僅供研究使用。