產(chǎn)品貨號：M7404S，M7404M

產(chǎn)品規(guī)格：5次反應(yīng)，100次反應(yīng)

儲存條件：2~8℃保存，有效期見外包裝

產(chǎn)品組分

產(chǎn)品介紹

本品是利用生物納米表面技術(shù)使Protein A/G高密度定向包被到超順磁性微球表面，與當(dāng)前國際免疫磁珠市場上同類產(chǎn)品相比，該產(chǎn)品具有更多的抗體結(jié)合位點(diǎn)，磁珠使用量更少，非特異性結(jié)合率低，可便捷高效地進(jìn)行免疫沉淀實(shí)驗(yàn)。每毫升免疫沉淀磁珠結(jié)合Human IgG的能力可達(dá)到300 μg以上，單個沉淀反應(yīng)僅需25 μL磁珠即可完成檢測。微米級磁珠提供的超大比表面積，大幅縮短抗體與抗原吸附所需的平衡時間，15 min內(nèi)即可完成抗體吸附過程，30 min內(nèi)完成抗原沉淀操作。簡短的操作時間避免長時間操作造成目標(biāo)蛋白水解，保證了目標(biāo)蛋白的活性及蛋白復(fù)合物的完整性。免疫沉淀磁珠試劑盒配有經(jīng)過優(yōu)化預(yù)制的緩沖液，為免疫沉淀實(shí)驗(yàn)提供了最佳的反應(yīng)條件，增強(qiáng)了免疫沉淀實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性。本產(chǎn)品可廣泛應(yīng)用于細(xì)胞裂解物、細(xì)胞分泌上清、血清、腹水等樣品中抗原的免疫沉淀反應(yīng)。操作者可以參考本操作說明書附表1的數(shù)據(jù)了解不同種屬來源及亞型的抗體與Protein A/G的結(jié)合能力。

操作流程

抗原樣品制備

本操作說明書提供以下四種樣品處理方法，建議您根據(jù)不同來源的抗原樣品選擇適當(dāng)?shù)姆绞竭M(jìn)行預(yù)處理，使待檢測抗原釋放至樣品溶液中。

1. 血清樣品處理：若目標(biāo)蛋白豐度較高，建議用結(jié)合緩沖液稀釋血清樣品至目標(biāo)蛋白終濃度為10~100 μg/mL，置于冰上備用（或置于-20℃長期保存）。

2. 懸浮細(xì)胞樣品處理：離心收集細(xì)胞（4℃, 500 g, 10 min），棄上清后稱重，按每毫克細(xì)胞50 μL的比例用1× PBS洗滌2次。

3. 懸浮細(xì)胞樣品處理：離心收集細(xì)胞（4℃, 500 g, 10 min），棄上清后稱重，按每毫克細(xì)胞50 μL的比例用1×PBS洗滌2次；按每毫克細(xì)胞5~10 μL的比例加入結(jié)合緩沖液，同時加入蛋白酶抑制劑（如終濃度為1 mM的PMSF），混勻后置于冰上處理10 min；離心收集上清液（4℃, 14000 g, 10 min），置于冰上備用（或置于-20℃長期保存）。

4. 貼壁細(xì)胞樣品處理：移去培養(yǎng)基，按每1.0×105個細(xì)胞150 μL的比例用1×PBS洗滌兩次；用細(xì)胞刮棒刮脫細(xì)胞，收集至 1.5 mL EP管內(nèi)，按每1.0×105個細(xì)胞20~30 μL的比例加入結(jié)合緩沖液，同時加入蛋白酶抑制劑（如終濃度為1 mM的PMSF），混勻后置于冰上處理10 min；離心收集上清液（4℃, 14000 g, 10 min），置于冰上備用（或置于-20℃長期保存）。

大腸桿菌樣品處理：離心收集大腸桿菌（4℃, 12000 g, 2 min），棄上清后稱重，按每克（濕重）菌體10 mL的比例用1×PBS洗滌2次；按每克（濕重）菌體5~10 mL的比例加入結(jié)合緩沖液，同時加入蛋白酶抑制劑（如終濃度為1 mM的PMSF），重懸菌體，超聲裂解細(xì)胞，離心收集上清（4℃, 17000 g, 10 min）。

磁珠預(yù)處理

將免疫沉淀磁珠漩渦振蕩1 min，使磁珠充分振蕩重懸；取25~50 μL磁珠懸液置于1.5 mL EP管中。加入200 μL結(jié)合緩沖液洗滌，進(jìn)行磁性分離（將EP管放置于磁性分離器上，使磁珠被吸附在管壁至溶液澄清；該操作描述以下省略），棄上清液，從磁性分離器上取下EP管，重復(fù)洗滌一次。最后加入200 μL結(jié)合緩沖液重懸磁珠以備用。

抗體結(jié)合反應(yīng)

1. 抗體工作液的制備：用結(jié)合緩沖液稀釋抗體樣品，配制成終濃度為5~50 μg/mL抗體工作液，置于冰上備用。

2. 抗體吸附：將步驟2預(yù)處理的磁珠懸液進(jìn)行磁性分離，棄上清液；加入200 μL抗體工作液，迅速重懸后在室溫下置于翻轉(zhuǎn)混合儀或者手工輕輕翻轉(zhuǎn)EP管，15 min后進(jìn)行磁性分離，收集上清液置于冰上以備后續(xù)檢測。

3. 洗滌：向EP管中加入200 μL結(jié)合緩沖液洗滌，用移液器輕輕吹打使磁珠-抗體復(fù)合物均勻分散，然后進(jìn)行磁性分離，棄上清液，從磁性分離器上取下EP管。重復(fù)以上洗滌操作一次。

抗體交聯(lián)反應(yīng)（備選）

如操作者需要將抗體和目標(biāo)抗原復(fù)合物共同洗脫，請忽略本步驟。本步驟適用于操作者需要單獨(dú)洗脫目標(biāo)抗原的試驗(yàn)，推薦使用BS3（Thermo Scientific, Cat. #21580）作為交聯(lián)劑，相關(guān)實(shí)驗(yàn)請參照該試劑的操作說明。

抗原沉淀反應(yīng)

1.抗原吸附：加入200 μL步驟1中制備的抗原樣品，用移液器輕輕吹打使抗原與磁珠-抗體復(fù)合物均勻分散。在室溫下置于翻轉(zhuǎn)混合儀或者手工輕輕翻轉(zhuǎn)EP管10 min，使抗原與抗體充分結(jié)合，如結(jié)合力較弱則可在室溫下反應(yīng)1 h或者在4℃下反應(yīng)過夜。

2.洗滌與轉(zhuǎn)移：將上述完成抗原吸附的磁珠-抗體-抗原復(fù)合物進(jìn)行磁性分離，收集上清液置于冰上以備后續(xù)檢測。向EP管中加入200 μL洗滌緩沖液洗滌，用移液器輕輕吹打使磁珠-抗體-抗原復(fù)合物均勻分散，然后進(jìn)行磁性分離，棄上清液；從磁性分離器上取下EP管，再重復(fù)洗滌兩次。最后加入200 μL洗滌緩沖液，用移液器將磁珠-抗體-抗原復(fù)合物懸液轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL EP管中*，并執(zhí)行磁性分離，移棄上清。

*注：抗原洗脫前務(wù)必將磁珠轉(zhuǎn)移到新的EP管，避免將管壁上原有的非特異性吸附蛋白一起洗脫。

抗原洗脫

本操作說明書提供以下兩種抗原洗脫方案，操作者可根據(jù)后期檢測的需要選擇不同的抗原洗脫方法。

1.變性洗脫法：此法洗脫的樣品適用于SDS-PAGE檢測。從磁性分離器上取下EP管，向其中加入25 μL 1× SDS-PAGE Loading Buffer（自備）混合均勻，95℃加熱5 min。然后執(zhí)行磁性分離（也可以使用室溫下13000 g, 10 min離心的方式），收集上清液進(jìn)行SDS-PAGE檢測。

2.非變性洗脫法：此方法洗脫的樣品保持原有的生物活性，可用于后期功能分析。從磁性分離器上取下EP管，向其中加入20 μL洗脫緩沖液混合均勻，室溫孵育10 min。然后執(zhí)行磁性分離（也可以使用4℃, 13000 g, 10 min離心的方式）， 收集上清液至新的EP管，并立即加入1.0 μL中和緩沖液將洗脫產(chǎn)物pH調(diào)節(jié)至中性，用于后期功能分析。

注意事項(xiàng)

1.進(jìn)行免疫沉淀操作之前，請務(wù)必認(rèn)真閱讀本操作說明書。

2.本產(chǎn)品須與磁性分離器配套使用。

3.磁珠使用前應(yīng)充分振蕩均勻。

4.磁珠應(yīng)保存在儲存溶液中，防止干燥。

5.請勿將磁珠冷凍或離心，以免引起不可逆聚集。

6. 10×PBS應(yīng)在無菌條件下稀釋，一旦發(fā)現(xiàn)溶液有污染情況，請停止使用該溶液。

7.為保證最佳的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，請選擇特異性較強(qiáng)的抗體進(jìn)行免疫沉淀反應(yīng)。

8.操作者可根據(jù)實(shí)際需求，利用抗體結(jié)合反應(yīng)步驟以及抗原結(jié)合反應(yīng)步驟中收集的上清液檢測抗體、抗原 和磁珠的結(jié)合情況。

9.對于IP實(shí)驗(yàn)，不同類型的抗體與抗原結(jié)合的親和性是有區(qū)別的，抗體與抗原結(jié)合還會受到結(jié)合緩沖液和洗滌緩沖液的影響，因此如果操作者使用本試劑盒提供的緩沖體系不能獲得很好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可自行篩選及配制緩沖液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

10. 本磁珠表面包被的重組蛋白Protein A/G在極端條件下（如低pH、加熱處理）存在極低的蛋白脫落情況，但仍然不建議操作者用于分子量約130 kD目標(biāo)蛋白的免疫沉淀實(shí)驗(yàn)。

常見問題及解答（FAQ）

Q1：如何提高抗體與磁珠結(jié)合效率?

A1：磁珠與抗體的結(jié)合效率與抗體的種屬來源及所屬亞型有關(guān)，請確認(rèn)抗體的類型與Protein A/G配基的親和效率（附表1）。如抗體所屬亞型與Protein A/G的親和度較低，可以通過增加抗體與磁珠的孵育時間（30~120 min）、提高結(jié)合緩沖液的pH值（8~9）及降低離子強(qiáng)度（25~100 mM NaCl）等方法提高親和效率。

Q2：如何提高磁珠在免疫沉淀反應(yīng)中的特異性?

A2：可以先將抗體與樣品進(jìn)行孵育，形成抗體-抗原復(fù)合物，再用Protein A/G磁珠捕獲復(fù)合物。這種方法可以提高抗體與抗原的結(jié)合效率，并降低磁珠與樣品接觸的時間，從而提高沉淀產(chǎn)物的特異性。對于蛋白質(zhì)/核酸共沉淀或染色質(zhì)免疫共沉淀也推薦使用此法。

Q3：如何避免磁珠在儲存或使用過程中可能出現(xiàn)的聚集情況？

A3：磁珠應(yīng)保存在2~8℃，使用時應(yīng)避免由于污染而導(dǎo)致的不可逆聚集，或因干燥而導(dǎo)致的聚集。磁珠在低pH的洗脫緩沖液中發(fā)生聚集屬于正常現(xiàn)象，不影響磁珠的正常使用。在Binding buffer和Elution buffer中添加終濃度為0.1%（v/v）的非離子型去垢劑（如NP-40、Tween-20或Triton X-100）可有效防止磁珠聚集。經(jīng)過低pH洗脫操作的

磁珠可以用結(jié)合緩沖液洗滌至中性，然后用含有0.1%（v/v）Tween-20的Tris buffer（pH7.5）振蕩重懸磁珠，并用超聲波水浴處理2 min，即可使磁珠恢復(fù)均勻狀態(tài)，以上處理均不影響磁珠的抗體結(jié)合效率。

Q4：如何解決磁珠易粘附管壁的現(xiàn)象？

A4：建議使用低吸附率的耗材進(jìn)行磁珠操作。另外，在緩沖液中添加0.01%～0.1%（v/v）的非離子型去垢劑

（如NP-40、Tween-20或Triton X-100)可以有效降低磁珠對耗材的粘附）。

Q5:磁珠在使用過程中出現(xiàn)結(jié)塊現(xiàn)象？

A5：磁珠在使用時如果出現(xiàn)結(jié)塊現(xiàn)象一般較難振蕩打散，容易導(dǎo)致分布不均，出現(xiàn)該問題的原因是磁珠在磁場中放置太久而使磁珠牢固的結(jié)合在一起。用超聲波水浴處理2 min即可打散磁珠使其重新分散，但應(yīng)注意超聲處理也會使磁珠在樣品溶液中捕獲的抗體脫落，所以磁珠在加樣后洗脫前不宜使用該方法。

附表1. 免疫磁珠Protein A/G與不同來源及類型的抗體親和性比較

注: “+”=weak binding，“+++”=medium binding，“+++++”=strong binding，“-”=no binding