產(chǎn)品貨號(hào)：M7401S，M7401M

產(chǎn)品規(guī)格：for 1×108 cells , for 5×108 cells

儲(chǔ)存條件：2~8℃保存，不可冷凍，有效期見外包裝

應(yīng)用范圍：分選小鼠脾臟和淋巴結(jié)CD4+ T細(xì)胞

產(chǎn)品組分

產(chǎn)品介紹

本品是通過(guò)陰性分選法從小鼠脾臟細(xì)胞或其它組織的單細(xì)胞懸液中分離出CD4+ T細(xì)胞。原理是選用不同的生物素（biotin）標(biāo)記單克隆抗體對(duì)非目標(biāo)細(xì)胞（非CD4+ T細(xì)胞）進(jìn)行標(biāo)記，而后通過(guò)鏈霉親和素（streptavidin）標(biāo)記的磁珠對(duì)非目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行清除，從而達(dá)到小鼠CD4+ T細(xì)胞分選的目的。分選過(guò)程需要用到磁力分離器。

實(shí)驗(yàn)步驟

以分選小鼠脾臟CD4+ T細(xì)胞為例：

1. 制備單細(xì)胞懸液：在70μm細(xì)胞篩網(wǎng)上研磨脾臟，以預(yù)冷的PBS沖洗細(xì)胞篩網(wǎng)，收集細(xì)胞懸液于50mL離心管中，500 g，離心5 min。

2. 離心結(jié)束，棄上清，加入5mL紅細(xì)胞裂解液（ACK），室溫裂解5 min，再加入20mL PBS，500 g，離心5 min。

注意：紅細(xì)胞裂解步驟可根據(jù)所用裂解液不同調(diào)整用量及時(shí)間。少量紅細(xì)胞殘留不會(huì)影響后續(xù)分選及細(xì)胞純度。

3. 離心完成后，棄上清，將脾細(xì)胞重懸于PBS，細(xì)胞懸液用70μm細(xì)胞篩網(wǎng)過(guò)濾后，計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)完成后，500 g，離心5 min。

注意：細(xì)胞懸液需要過(guò)細(xì)胞篩網(wǎng)，以除去組織和細(xì)胞團(tuán)塊，否則會(huì)影響后續(xù)細(xì)胞分選純度。

4. 離心完成后，棄上清，將細(xì)胞重懸于分選buffer中，調(diào)整細(xì)胞密度為1×108 cells/mL。

注意：分選buffer為含有2 mM EDTA和2%胎牛血清（FBS）的PBS或者含有2 mM EDTA和0.5% BSA的PBS，需預(yù)先通過(guò)0.22μm濾膜過(guò)濾除菌。

5. 將100μL細(xì)胞懸液（1×107個(gè)細(xì)胞）加入無(wú)菌流式管底部，再加入2μLBiotin-Antibody Mix，混勻后4℃孵育10 min。

注意：加入細(xì)胞懸液時(shí)將細(xì)胞加入流式管底部，避免沿流式管管壁加入。根據(jù)所使用磁力架不同也可使用離心管進(jìn)行細(xì)胞分選。如果分選更多細(xì)胞，則按比例增加Biotin-Antibody Mix的用量。

6. 孵育完成后，在流式管中加入20μL清洗過(guò)的Streptavidin Beads（磁珠使用前需要用分選buffer進(jìn)行清洗：渦旋振蕩重懸磁

珠，吸取實(shí)驗(yàn)需要的磁珠至1.5mL 離心管，加入1mL分選buffer，10000 g離心1 min，棄上清。加入1mL分選buffer重復(fù)洗滌磁珠1次后用與原來(lái)相同體積的分選buffer重懸磁珠。如吸取20μL磁珠進(jìn)行清洗，則清洗后用20μL分選buffer進(jìn)行重懸），混勻后4℃孵育10 min。

注意：如果分選更多細(xì)胞，則按比例增加Streptavidin Beads用量。例如分選5×107個(gè)細(xì)胞，在500μL細(xì)胞懸液中加入10 μL Biotin-Antibody Mix和100μL Streptavidin Beads。如果分選少于1×107個(gè)細(xì)胞，則將細(xì)胞懸液體積補(bǔ)至100μL，加入2μLBiotin-Antibody Mix和20μLStreptavidin Beads。

7. 孵育完成后，在流式管中加入2.5mL分選buffer，用移液器上下混合吹打5次混勻（避免劇烈振蕩或者上下顛倒混勻）。

8. 將含有細(xì)胞的分選流式管置于磁力架上，靜置5 min。

9. 將細(xì)胞懸液輕柔倒入一個(gè)無(wú)菌離心管中（傾倒過(guò)程中流式管不要脫離磁力架），此細(xì)胞懸液中即包含純化的小鼠CD4+ T細(xì)胞，500 g，離心5 min。離心后棄上清，收集細(xì)胞。

10. 根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要洗滌細(xì)胞后，將細(xì)胞重懸于所需緩沖液或培養(yǎng)基中，即可用于后續(xù)分子生物學(xué)或細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。

圖1.本產(chǎn)品分選效果圖

從C57BL/6小鼠脾臟細(xì)胞中分選CD4+ T細(xì)胞，分選前后的細(xì)胞用FITC anti-mouse CD4抗體（克隆號(hào)GK1.5）標(biāo)記后進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析，分選前后的CD4+ T細(xì)胞純度分別為20.3%和98.8%。

注意事項(xiàng)

1. 磁珠和抗體混合液使用和保存過(guò)程中均應(yīng)避免冷凍、高速離心等操作；

2. 建議選用低吸附移液器吸頭和離心管，避免因吸附造成磁珠和抗體的損耗；

3. 本產(chǎn)品需與磁性分離器配套使用；

4. 本產(chǎn)品僅供研究使用。