產品概述：

儲存條件

-20 ℃ 保存，有效期見外包裝

產品內容

規格 組分	T6068S（20 T）	T6068L（50 T）
A. Biotin TUNEL Reaction Buffer	1 mL	2 × 1.25 mL
B. TdT Enzyme	40 μL	100 μL
C. Streptavidin-HRP	20 μL	50 μL
D. Streptavidin-HRP稀釋液	1 mL	2 × 1.25 mL
E.DAB濃縮液（20×）	50 μL	125 μL
F. DAB稀釋液	1 mL	2 × 1.25 mL
G.顯色增強劑（10×）	100 μL	250 μL
H. Proteinase K（2 mg/mL）	40 μL	100 μL
I. DNase I（2 U/μL）	5 μL	13 μL
J. 10× DNase I Buffer	100 μL	260 μL

注：（1）組分A、C、E、F需避光保存。（2）組分B、C、H、I請注意冰上操作。（3）組分F避免反復凍融，建議分裝保存。（4）使用前請將產品瞬時離心至管底，再進行后續實驗。

產品介紹

細胞發生凋亡時，一些DNA內切酶被激活，這些內切酶會切斷核小體間的基因組DNA，產生180 bp-200 bp的DNA 片段，斷裂的DNA片段暴露出大量的粘性3'-OH末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶（TdT）的催化作用下，與生物素（Biotin）-dUTP結合，隨后和辣根過氧化物酶（HRP）標記的Streptavidin（Streptavidin-HRP）結合，最后在HRP的催化下通過DAB顯色來顯示凋亡細胞，從而通過光學顯微鏡直接進行凋亡細胞的檢測，這類方法稱為脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法（Terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labeling, TUNEL）。

本試劑盒應用范圍廣，可用于檢測冷凍或石蠟切片中的細胞凋亡情況，也可檢測培養的貼壁細胞或懸浮細胞的凋亡情況?？蛇x擇性的檢測凋亡細胞，而非壞死細胞或因輻照和藥物治療而造成的DNA鏈斷裂的細胞。

注意事項

1．使用前請將產品瞬時離心至管底，再進行后續實驗。

2．疊氮化鈉對HRP有抑制作用，實驗中請勿使用含有疊氮化鈉的試劑。

3．本產品僅限于科研，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品和藥品，不得存放于普通住宅內。

4．為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

說明書：

 UE-T6068S/T6068L    

常見問題解答：

◆為什么出現了一些非特異標記？

1. 有些細胞或組織，比如平滑肌核酸酶或聚合酶活性水平較高，使得DNA全部被切斷，易導致假陽性。建議：取出細胞或組織后要立即固定并充分固定，以阻止這些酶的活性，同時設置陰性對照。
2. 內源性過氧化物酶影響，建議：對于肝臟、腎臟等血細胞含量多的組織，適當延長封閉時間和升高過氧化氫的濃度。
3. 固定液濃度過高或過低，導致組織中心部分固定效果不佳，而使得中心部細胞自溶、DNA鏈出現不規則斷裂，產生假陽性。建議：推薦使用4%多聚甲醛。
4. TdT 酶反應時間過長或Tunel反應過程中反應液發生蒸發或滲漏，細胞或組織表面不能保持濕潤。注意控制反應時間，并確保TdT 酶反應液能很好地覆蓋樣品。
5. 石蠟、脂肪、血液、體液等都較易與染料結合，所以組織切片制作時要保持干凈、脫蠟要徹底。
6. 有些試劑或細胞存在自發熒光，選擇染料時要避開自發熒光的顏色。

◆為什么沒有染上熒光？
1. 固定不充分。固定液首選4%多聚甲醛，現用現配。不建議使用乙醇，乙醇固定液對組織的滲透力較弱，影響TUNEL標記效率.
2. 細胞膜和核膜的通透不充分，TdT酶未能到達核內。細胞與冰凍切片，可用0.2% Triton X-100溶液通透5-30min，石蠟切片推薦使用蛋白酶K，37℃通透30 min；不同的細胞和組織所需要的通透時間略有不同，時間太長容易脫片，適當調整。
3. 延長標記時間至2h，并適當增加TdT酶及dUTP的用量。
4. 確定實驗對象細胞有凋亡。準備一份DNase I處理的陽性對照，驗證TdT酶反應是否正確進行。

◆如何對細胞核進行復染？
可在TUNEL反應結束后對細胞核進行染色。

◆為什么熒光背景高？
1. 支原體污染：可以使用支原體染色檢測試劑盒驗證。
2. TdT 酶反應時間過長，可以用試劑盒提供的TdT酶稀釋液將TdT酶稀釋2-5倍后再按照說明書操作，稀釋后的TdT酶僅供當日使用。
3. 處于高速分裂和增殖狀態中的細胞，有時也會出現細胞核中的DNA 斷裂。建議：在非高增殖期取樣檢測；
4. 有些試劑或細胞存在自發熒光，選擇染料時要避開自發熒光的顏色。
5. DAB 孵育時間過長，減少DAB 染色時間。
6. Biotin-X-dUTP 的非特異性結合，在TdT 酶反應之后，再用含0.1% Triton X-100 和1 mg/ml BSA 的PBS 洗三次。

◆標記率低？
1. 乙醇、甲醇或甲醛（市面上購買的甲醛大多含有甲醇）固定的樣品標記效率較低（因為在固定時染色質未能與蛋白質交聯，而在操作中丟失），采用推薦的固定液。
2. 固定時間過長，導致交聯程度過高，減少固定時間。
3. 貼壁細胞如果使用藥物誘導凋亡，會細胞皺縮，貼壁黏附力降低，導致凋亡細胞容易脫落。建議：在凋亡誘導結束后，可以對多孔板進行1000g離心5min，然后再吸出培養基并用PBS洗滌。如果沒有適合的離心機，請注意操作輕緩，防止發生凋亡的細胞在洗滌時被洗去。后續整個操作也需要輕緩。

◆在蛋白酶K中消化組織樣品多久？
大部分組織樣品需要充分消化15分鐘。最佳的培養時間根據組織類型和厚度而不同。腦組織比其他組織需要更長的蛋白酶處理時間。 

◆實驗的組織切片應該多厚？
老鼠腸、腎臟、肝臟、心臟和結腸厚度5–20 μm。

使用本產品的文獻：

參考文獻
1.Enhanced anti-tumor activity by the combination of TRAIL/Apo-2L and combretastatin A-4 against human colon cancer cells via induction of apoptosis in vitro and in vivo.
應用方向：檢測結腸癌細胞的凋亡

2.Antiproliferation and cell apoptosis inducing bioactivities of constitUEnts from Dysosma versipellis in PC3 and Bcap-37 cell lines.
應用方向：檢測人前列腺癌細胞株PC3、乳腺癌細胞株Bcap-37、胃癌細胞株BGC-823的凋亡

3.Caudatin-2,6-dideoxy-3-O-methy-β-D-cymaropyranoside 1 induced apoptosis through caspase 3-dependent pathway in human hepatoma cell line SMMC7721.
應用方向：檢測人肝癌細胞系SMMC7721的凋亡

4.Chemical constitUEnts of the ethyl acetate extract of Belamcanda chinensis (L.) DC roots and their antitumor activities.
應用方向：檢測PC3、MGC-803、Bcap-37和MCF-7細胞系的凋亡

5.Synthesis and cytotoxicity of novel ursolic acid derivatives containing an acyl piperazine moiety.
應用方向：檢測胃癌細胞MGC-803和乳腺癌細胞Bcap-37的凋亡