產品概述：
產品貨號：
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產品貨號 |
產品名稱 |
Ex/Em (nm) |
產品規格 |
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T6013S |
YF®488 TUNEL細胞凋亡試劑盒 （綠色，通用型） |
490/515 |
20 T |
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T6013L |
50 T |
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T6039S |
YF®555 TUNEL細胞凋亡試劑盒 （橙紅色，通用型） |
555/565 |
20 T |
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T6039L |
50 T |
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T6014S |
YF®594 TUNEL細胞凋亡試劑盒 （紅色，通用型） |
590/617 |
20 T |
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T6014L |
50 T |
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T6063S |
YF®640 TUNEL細胞凋亡試劑盒 （遠紅，通用型） |
642/662 |
20 T |
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T6063L |
50 T |
產品規格：
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規格 組分 |
20 T |
50 T |
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A. YF®488/555/594/640 TUNEL Reaction Buffer |
1 mL |
2 × 1.25 mL |
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B. TdT Enzyme |
40 μL |
100 μL |
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C. Proteinase K (2 mg/mL) |
40 μL |
100 μL |
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D. DNase I (2 U/μL) |
5 μL |
13 μL |
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E. 10 × DNase I Buffer |
100 μL |
260 μL |
儲存條件：-20℃保存，組分A需避光，避免反復凍融。有效期見外包裝。冰袋運輸。
應用范圍：細胞凋亡檢測。
產品介紹
細胞發生凋亡時, 會激活一些DNA內切酶，這些內切酶會切斷核小體間的基因組DNA，產生180 bp-200 bp的 DNA 片段，表現為瓊脂糖凝膠電泳中呈現的特異的梯狀Ladder圖譜。基因組DNA雙鏈或單鏈斷裂時會出現產生大量的粘性3'-OH末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶（TdT）的催化作用下，與YF® -dUTP結合，從而通過熒光顯微鏡或流式細胞儀直接進行凋亡細胞的檢測，這類方法稱為脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法（Terminal - deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL）。由于正常的或正在增殖的細胞幾乎沒有DNA的斷裂，因而沒有3'-OH形成，很少能夠被染色。Tunel法可以對完整的單個凋亡細胞核或凋亡小體進行原位染色，能準確地反應細胞凋亡典型的生物化學和形態特征，可檢測出極少量的凋亡細胞，因而在細胞凋亡的研究中廣泛采用。
本試劑盒應用范圍廣，可用于檢測冷凍或石蠟切片中的細胞凋亡情況，也可檢測培養的貼壁細胞或懸浮細胞的凋亡情況。可選擇性的檢測凋亡細胞，而非壞死細胞或因輻照和藥物治療而造成的 DNA 鏈斷裂的細胞。本試劑盒檢測細胞凋亡，耗時短，只需一步染色反應，洗滌后即可檢測。
注意事項
1. 使用前請將產品瞬時離心至管底，再進行后續實驗。
2. 染色背景較重或非特異性著色明顯時可適當減少染色時間。
3. 實驗時建議增加陰性對照和陽性對照組。
4. 組分A使用時請佩戴口罩、手套，如接觸皮膚，請立即用大量水沖洗。
5. 熒光染料均存在淬滅問題，請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。
6. 本產品僅限于科研，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內。
7. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
常見問題解答：
◆為什么出現了一些非特異標記？
1. 有些細胞或組織，比如平滑肌核酸酶或聚合酶活性水平較高，使得DNA全部被切斷，易導致假陽性。建議：取出細胞或組織后要立即固定并充分固定，以阻止這些酶的活性，同時設置陰性對照。
2. 內源性過氧化物酶影響，建議：對于肝臟、腎臟等血細胞含量多的組織，適當延長封閉時間和升高過氧化氫的濃度。
3. 固定液濃度過高或過低，導致組織中心部分固定效果不佳，而使得中心部細胞自溶、DNA鏈出現不規則斷裂，產生假陽性。建議：推薦使用4%多聚甲醛。
4. TdT 酶反應時間過長或Tunel反應過程中反應液發生蒸發或滲漏，細胞或組織表面不能保持濕潤。注意控制反應時間，并確保TdT 酶反應液能很好地覆蓋樣品。
5. 石蠟、脂肪、血液、體液等都較易與染料結合，所以組織切片制作時要保持干凈、脫蠟要徹底。
6. 有些試劑或細胞存在自發熒光，選擇染料時要避開自發熒光的顏色。
◆為什么沒有染上熒光？
1. 固定不充分。固定液首選4%多聚甲醛，現用現配。不建議使用乙醇，乙醇固定液對組織的滲透力較弱，影響TUNEL標記效率.
2. 細胞膜和核膜的通透不充分，TdT酶未能到達核內。細胞與冰凍切片，可用0.2% Triton X-100溶液通透5-30min，石蠟切片推薦使用蛋白酶K，37℃通透30 min；不同的細胞和組織所需要的通透時間略有不同，時間太長容易脫片，適當調整。
3. 延長標記時間至2h，并適當增加TdT酶及dUTP的用量。
4. 確定實驗對象細胞有凋亡。準備一份DNase I處理的陽性對照，驗證TdT酶反應是否正確進行。
◆如何對細胞核進行復染？
可在TUNEL反應結束后對細胞核進行染色。
◆為什么熒光背景高？
1. 支原體污染：可以使用支原體染色檢測試劑盒驗證。
2. TdT 酶反應時間過長，可以用試劑盒提供的TdT酶稀釋液將TdT酶稀釋2-5倍后再按照說明書操作，稀釋后的TdT酶僅供當日使用。
3. 處于高速分裂和增殖狀態中的細胞，有時也會出現細胞核中的DNA 斷裂。建議：在非高增殖期取樣檢測；
4. 有些試劑或細胞存在自發熒光，選擇染料時要避開自發熒光的顏色。
5. DAB 孵育時間過長，減少DAB 染色時間。
6. Biotin-X-dUTP 的非特異性結合，在TdT 酶反應之后，再用含0.1% Triton X-100 和1 mg/ml BSA 的PBS 洗三次。
◆標記率低？
1. 乙醇、甲醇或甲醛（市面上購買的甲醛大多含有甲醇）固定的樣品標記效率較低（因為在固定時染色質未能與蛋白質交聯，而在操作中丟失），采用推薦的固定液。
2. 固定時間過長，導致交聯程度過高，減少固定時間。
3. 貼壁細胞如果使用藥物誘導凋亡，會細胞皺縮，貼壁黏附力降低，導致凋亡細胞容易脫落。建議：在凋亡誘導結束后，可以對多孔板進行1000g離心5min，然后再吸出培養基并用PBS洗滌。如果沒有適合的離心機，請注意操作輕緩，防止發生凋亡的細胞在洗滌時被洗去。后續整個操作也需要輕緩。
◆在蛋白酶K中消化組織樣品多久？
大部分組織樣品需要充分消化15分鐘。最佳的培養時間根據組織類型和厚度而不同。腦組織比其他組織需要更長的蛋白酶處理時間。
◆實驗的組織切片應該多厚？
老鼠腸、腎臟、肝臟、心臟和結腸厚度5–20 μm。
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