產品概述：
產品貨號：
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產品貨號 |
產品名稱 |
Ex/Em (nm) |
產品規格 |
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T6013S |
YF®488 TUNEL細胞凋亡試劑盒 （綠色，通用型） |
490/515 |
20 T |
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T6013L |
50 T |
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T6039S |
YF®555 TUNEL細胞凋亡試劑盒 （橙紅色，通用型） |
555/565 |
20 T |
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T6039L |
50 T |
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T6014S |
YF®594 TUNEL細胞凋亡試劑盒 （紅色，通用型） |
590/617 |
20 T |
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T6014L |
50 T |
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T6063S |
YF®640 TUNEL細胞凋亡試劑盒 （遠紅，通用型） |
642/662 |
20 T |
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T6063L |
50 T |
產品規格：
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規格 組分 |
20 T |
50 T |
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A. YF®488/555/594/640 TUNEL Reaction Buffer |
1 mL |
2 × 1.25 mL |
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B. TdT Enzyme |
40 μL |
100 μL |
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C. Proteinase K (2 mg/mL) |
40 μL |
100 μL |
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D. DNase I (2 U/μL) |
5 μL |
13 μL |
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E. 10 × DNase I Buffer |
100 μL |
260 μL |
儲存條件：-20℃保存，組分A需避光，避免反復凍融。有效期見外包裝。冰袋運輸。
應用范圍：細胞凋亡檢測。
產品介紹
細胞發生凋亡時, 會激活一些DNA內切酶，這些內切酶會切斷核小體間的基因組DNA，產生180 bp-200 bp的 DNA 片段，表現為瓊脂糖凝膠電泳中呈現的特異的梯狀Ladder圖譜。基因組DNA雙鏈或單鏈斷裂時會出現產生大量的粘性3'-OH末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶（TdT）的催化作用下，與YF® -dUTP結合，從而通過熒光顯微鏡或流式細胞儀直接進行凋亡細胞的檢測，這類方法稱為脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法（Terminal - deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL）。由于正常的或正在增殖的細胞幾乎沒有DNA的斷裂，因而沒有3'-OH形成，很少能夠被染色。Tunel法可以對完整的單個凋亡細胞核或凋亡小體進行原位染色，能準確地反應細胞凋亡典型的生物化學和形態特征，可檢測出極少量的凋亡細胞，因而在細胞凋亡的研究中廣泛采用。
本試劑盒應用范圍廣，可用于檢測冷凍或石蠟切片中的細胞凋亡情況，也可檢測培養的貼壁細胞或懸浮細胞的凋亡情況。可選擇性的檢測凋亡細胞，而非壞死細胞或因輻照和藥物治療而造成的 DNA 鏈斷裂的細胞。本試劑盒檢測細胞凋亡，耗時短，只需一步染色反應，洗滌后即可檢測。
注意事項
1. 使用前請將產品瞬時離心至管底，再進行后續實驗。
2. 染色背景較重或非特異性著色明顯時可適當減少染色時間。
3. 實驗時建議增加陰性對照和陽性對照組。
4. 組分A使用時請佩戴口罩、手套，如接觸皮膚，請立即用大量水沖洗。
5. 熒光染料均存在淬滅問題，請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。
6. 本產品僅限于科研，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內。
7. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
常見問題解答：
◆為什么出現了一些非特異標記？
1. 有些細胞，比如平滑肌核酸酶或聚合酶活性水平較高，使得DNA全部被切斷，易導致假陽性。建議:取出細胞后要立即固定并充分固定，以阻止這些酶的活性，同時設置陰性對照.
2. 固定液濃度過高或過低，導致中心部分細胞固定效果不佳，而使得中心部細胞自溶、DNA鏈出現不規則斷裂，產生假陽性。建議:推薦使用4%多聚甲醛。
3. TdT 酶反應時間過長或Tunel反應過程中反應液發生蒸發或滲漏，細胞表面不能保持濕潤。注意控制反應時間，并確保TdT 酶反應液能很好地覆蓋樣品。
4. 有些試劑或細胞存在自發熒光，選擇染料時要避開自發熒光的顏色。
◆為什么沒有染上熒光？
1. 固定不充分。固定液首選4%多聚甲醛，現用現配。不建議使用乙醇，乙醇固定液的滲透力較弱，影響TUNEL標記效率。
2. 細胞膜和核膜的通透不充分，TdT酶未能到達核內。細胞可用0.2% Triton X-100溶液通透5-30min，不同的細胞所需要的通透時間略有不同，適當調整。
3. 延長標記時間至2h，并適當增加TdT酶及dUTP的用量。
4. 確定實驗對象細胞有凋亡。準備一份DNase I處理的陽性對照，驗證TdT酶反應是否正確進行。
◆如何對細胞核進行復染？
可在TUNEL反應結束后對細胞核進行染色。
◆為什么熒光背景高？
1. 支原體污染：可以使用支原體染色檢測試劑盒驗證。
2. TdT 酶反應時間過長，可以用試劑盒提供的TdT酶稀釋液將TdT酶稀釋2-5倍后再按照說明書操作，稀釋后的TdT酶僅供當日使用。
3. 處于高速分裂和增殖狀態中的細胞，有時也會出現細胞核中的DNA 斷裂。建議：在非高增殖期取樣檢測；
4. 有些試劑或細胞存在自發熒光，選擇染料時要避開自發熒光的顏色。
5. DAB 孵育時間過長，減少DAB 染色時間。
6. Biotin-X-dUTP 的非特異性結合，在TdT 酶反應之后，再用含0.1% Triton X-100 和1 mg/ml BSA 的PBS 洗三次。
◆標記率低？
1. 乙醇、甲醇或甲醛（市面上購買的甲醛大多含有甲醇）固定的樣品標記效率較低（因為在固定時染色質未能與蛋白質交聯，而在操作中丟失），采用推薦的固定液。
2. 固定時間過長，導致交聯程度過高，減少固定時間。
3. 貼壁細胞如果使用藥物誘導凋亡，會細胞皺縮，貼壁黏附力降低，導致凋亡細胞容易脫落。建議：在凋亡誘導結束后，可以對多孔板進行1000g離心5min，然后再吸出培養基并用PBS洗滌。如果沒有適合的離心機，請注意操作輕緩，防止發生凋亡的細胞在洗滌時被洗去。后續整個操作也需要輕緩。
使用本產品的文獻：
1.Caffeine Targets SIRT3 to Enhance SOD2 Activity in Mitochondria
Huanhuan Xu, Chunxia Gan, Ziqi Gao, Yewei Huang, Simin Wu, Dongying Zhang, Xuanjun Wang，Jun Sheng
Frontiers in Cell and Developmental Biology
2.Exposure to Automobile Exhaust-Derived PM2.5 Induces Spermatogenesis Dysfunction by Damaging UPRmtof Prepubertal Rats
Cao Wang, Xiang Liu, Zhen Shu, Jia Yin, Mingchen Xiao, Yaya Ai, Peng Zhao, Zhen Luo, Bin Liu
Ecotoxicology and invironmental safety
3.Protective effect and mechanism of Qingfei Paidu decoction on myocardial damage mediated by influenza viruses
Lijuan Du, Jing Zhao, Nanxi Xie4, Huangze Xie, Jiating Xu, Xiaoming Bao, Yingsong Zhou, Hui Liu, Xiao Wu, Xin Hu, Tianyi He, Shujun Xu1, Yuejuan Zheng
Frontiers in Pharmacology
1.Apoptosis caused by Hsp90 inhibitor geldanamycin in Leishmania donovani during promastigote-to-amastigote transformation stage
應用方向：細胞凋亡染色&流式分析
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