產品概述：
產品內容
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組分 |
Y6102S (10T) |
Y6102M（50T） |
Y6102L (100T) |
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A. 1× Annexin V 結合緩沖液 |
10 mL |
50 mL |
50 mL×2 |
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B. YF®488-Annexin V |
50 μL |
250 μL |
500 μL |
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C. RedNucleus II |
100 μL |
500 μL |
1 mL |
儲存條件
4℃避光冷藏，請勿凍存。有效期見外包裝。
光譜特性
YF®488-Annexin V：Ex/Em=490/515 nm
RedNucleus II：Ex/Em=635/695 nm
產品介紹
Annexin V（膜聯蛋白-V）是一種分子量為 35-36 KD的 Ca2+依賴性磷脂結合蛋白，可與磷脂酰絲氨酸（PS）選擇性結合。磷脂酰絲氨酸（PS）主要分布在細胞膜內側，即與細胞漿相鄰的一側。在細胞發生凋亡的早期，不同類型的細胞都會把磷脂酰絲氨酸外翻到細胞表面，暴露在細胞外環境中。此時，使用綠色熒光探針 YF®488的 Annexin V, 即 YF®488-Annexin V，與外翻的磷脂酰絲氨酸（PS）結合，就可用流式細胞儀直接檢測到磷脂酰絲氨酸的外翻這一細胞凋亡的重要特征。正常細胞不會被 YF®488-Annexin V所染色，發生凋亡或壞死的細胞會被 YF®488-Annexin V 所染色。YF®488-Annexin V可以與部分非滲透性的細胞核染料（7-AAD/PI）等聯合使用，區分處于不同凋亡時期的細胞。
本試劑盒中提供的 RedNucleus II 是一種遠紅光染料，屬于蒽醌類化合物，不能透過活細胞和早期凋亡細胞完整的細胞膜，是非滲透性的，但是可以快速染色死亡和透化細胞中的細胞核/dsDNA。RedNucleus II 是一種理想的碘化丙啶（PI）和 7-AAD 的替代物。YF®488 與 RedNucleus II 之間光譜無交叉。與 YF®488-Annexin V 聯用，對于無自發熒光、自帶 RFP 或阿霉素誘導凋亡的細胞，都無需補償調節。
注意事項
1. 使用前請將產品瞬時離心至管底，再進行后續實驗。
2. 為降低細胞凋亡進程，孵育過程可在冰上操作，但孵育時間至少延長至30 min。
3. 由于細胞凋亡是一個快速的過程，建議樣品在染色后 1 h之內進行分析。
4. 對于貼壁細胞，消化是一個關鍵步驟。貼壁細胞誘導細胞凋亡時如有漂浮細胞，需收集漂浮細胞和貼壁細胞后合并染色。處理貼壁細胞時要小心操作，盡量避免人為的損傷細胞。胰酶消化時間過短，細胞需要用力吹打才能脫落，容易造成細胞膜的損傷，RedNucleus II 攝入過多；消化時間過長，細胞膜同樣易造成損傷，甚至會影響細胞膜上磷脂酰絲氨酸與 YF®488-Annexin V的結合。消化時將胰酶鋪滿孔板底后，輕搖時胰酶與細胞充分接觸，然后倒掉大部分胰酶，利用剩余的少量胰酶再消化一段時間，待細胞間空隙增大，瓶底呈花斑狀即可終止。在消化液中盡量不用 EDTA，EDTA 會影響 Annexin V 與 PS 的結合。
5. 貼壁細胞用胰蛋白酶消化后，建議在最佳培養條件和培養基中恢復約30 min后染色，避免假陽性。
6. 為了避免洗滌細胞時損失細胞，在吸液時可以用大的 Tip 頭套上小的 Tip 頭吸液。
7. 染料的最佳使用濃度由具體實驗要求確定。
8. 熒光染料均存在淬滅問題，保存和使用過程中請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。
9. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
常見問題解答：
◆為何染色結果顯示細胞凋亡率過高？
1. 凋亡時間處理過長，使細胞全部死亡。建議重新摸索細胞凋亡條件，使細胞處于不同的凋亡狀態。
2. 對于貼壁細胞，胰蛋白酶消化時間過長或機械刮擦細胞會暫時破壞質膜，使Annexin V能夠與細胞膜胞內面上的磷脂酰絲氨酸結合，導致假陽性染色。建議在胰蛋白酶消化或機械刮擦細胞后，讓細胞在最佳細胞培養條件和培養基中培養約30分鐘，以恢復其膜完整性。
◆實驗結果使用什么儀器觀察？
實驗結果可以通過流式細胞儀和熒光顯微鏡進行觀察，但更推薦使用流式細胞儀。因為正常的細胞和凋亡的細胞膜上都有磷脂酰絲氨酸（PS），只是凋亡細胞膜外更多，可以結合更多的Annexin V，流式細胞儀更靈敏，可以區分出微小差異，將正常細胞與凋亡細胞分成不同的兩群，但如果用熒光顯微鏡，可能觀察不到這一差別，尤其是貼壁細胞。若要在成像測定中檢測細胞凋亡，推薦使用SuperView? 488 Caspase-3 Assay Kit for Live Cells。
◆流式細胞儀檢測細胞凋亡，結果圖中的各個象限代表什么狀態的細胞？
左上角：Annexin V-/PI+，機械損傷細胞；右上角: AnnexinV+/PI+，晚期凋亡細胞或壞死；右下角：AnnexinV+/PI-，早期凋亡細胞；左下角：AnnexinV-/PI-，正常細胞。
◆這款試劑盒可同時檢測出凋亡率和細胞周期分布嗎？
不可以。檢測細胞凋亡時PI結合的是核酸，包括DNA和RNA。而PI用于檢測細胞周期時需要只結合DNA，由于RNA的干擾，用細胞凋亡檢測試劑盒測出來的細胞周期不準。同時，凋亡檢測與周期檢測時PI的工作濃度以及樣本處理都不一樣。 如果需要進行細胞周期檢測，推薦Cell Cycle and Apoptosis Kit（C6031）
◆各象限代表的細胞狀態問題？
Q1：(AnnexinV-染料)-/PI+，此區域的細胞為壞死細胞。也可能有少數的晚期凋亡細胞在其中，甚至機械損傷的細胞也包含其中。Annexin V-/PI+越多，實驗結果越不可信，建議實驗中盡量控制這一象限細胞比例。
Q2: (AnnexinV+染料)+/PI+，此區域的細胞為晚期凋亡細胞或壞死。
Q3：(AnnexinV-染料)+/PI-，此區域的細胞為早期凋亡細胞。
Q4：(AnnexinV-染料)-/PI-，此區域的細胞為活細胞。
◆假陽性問題？
1. 消化液中含有EDTA或消化時間過長引起的假陽性。Annexin V和PS的結合需要Ca2+，而EDTA是Ca2+螯合劑，使用含有EDTA的胰酶會造成假陰性。其次消化時間不宜過長，吹打細胞要輕柔，因為胰酶的過度消化和機械損傷都會引起細胞膜的損傷，造成假陽性。細胞消化下來后，建議在培養箱中在孵育30min，使細胞膜恢復完整性，避免假陽性，或者將細胞報訊在含2% BSA的PBS中，防止進一步的損傷。2. 如果樣品來源于血液，必須去除血液中的血小板，因為血小板含有PS，能與Annexin V結合，干擾實驗結果。建議：可以含有EDTA的緩沖液200g離心去除血小板， 最后細胞多洗幾遍，減小EDTA螯合鈣離子產生的影響。
3. 神經細胞膜容易破壞外翻，導致假陽性，所以Annexin V/PI 雙染法流式檢測細胞凋亡不適用于神經細胞。
4. 誘導時間過長。一般情況下誘導幾個小時就可以出現早期凋亡，因此通常不需要處理大于48小時以上，誘導時間過長會使營養物質耗盡，導致細胞狀態差，假陽性結果偏高。
◆熒光染料選擇的問題？
1. 實驗樣本是否帶熒光，因為感染病毒或質粒轉染的細胞往往帶GFP熒光，GFP與YF488/FITC通道重疊，不能選擇YF488/FITC標記的Annexin V，此時如果只有488 nm一根激光管可以用PE標記Annexin V，用7-AAD代替PI，若有633 nm激光管，可以改用YF647 Annexin V代替YF488。
2. 如果流式細胞儀帶有488 nm和633 nm兩個或以上激光管，首先考慮用APC或YF647標記 Annexin V，因為它和PI通道幾乎不用考慮光重疊問題，可以減少調節補償的煩惱，如果只有488 nm激光管則可選擇YF488/FITC標記的Annexin V。
3. 處理因素是否帶有熒光，本實驗室就碰到過一個促凋亡藥物Doxorubicin本身發紅色熒光，對PI通道的檢測造成嚴重干擾，而且濃度越大干擾越明顯。這時建議選用A6079或Y6102 。
◆圈門問題？
1.要特別注意在FSC/SSC圈門時，所選細胞范圍會對結果造成較大影響，所以在分析數據時，要把所有細胞都圈進FSC/SSC的門內，這樣實驗結果才會更可信。如圖，使細胞群大概位于對角線上，并且細胞群較集中，群內細胞比例要在80%以上，如果細胞全部圈入，細胞比例才50%或者更低，說明細胞被壓在了坐標軸上，這時要重新調節FSC和SSC。
2.貼壁細胞做Annexin V凋亡檢測，通常分群不太規則，這時我們可以根據不加藥細胞來畫不規則的十字門。如上面圖形的設門方式：
◆免疫染色與凋亡染色順序問題?
Annexin V凋亡染色可以和抗體一起對細胞進行染色嗎？
可以，但建議Annexin V和其它抗體分開染色。例如Annexin V、PI和CD3、CD8同時標記淋巴細胞，可以先在PBS中標記CD3/CD8后洗去，再在Binding buffer（含鈣離子）中標記Annexin V。
◆這款試劑盒可同時檢測出凋亡率和細胞周期分布嗎？
不可以。檢測細胞凋亡時PI結合的是核酸，包括DNA和RNA。而PI用于檢測細胞周期時需要只結合DNA，由于RNA的干擾，用細胞凋亡檢測試劑盒測出來的細胞周期不準。同時，凋亡檢測與周期檢測時PI的工作濃度以及樣本處理都不一樣。 若果需要進行細胞周期檢測，推薦Cell Cycle and Apoptosis Kit（C6031）
◆固定、冷凍、切片或解離的組織，還可以做流式細胞分析嗎？
不建議做流式細胞分析。因為流式細胞分析要求細胞分散、單個，活性好，這些狀態下的樣本外膜上的PS及膜的完整性都受到了影響，因此無法依賴膜的完整性區分健康細胞和凋亡細胞。組織在凍存、復溫的過程中會有大量的細胞死亡，同時經過這一過程的組織在分離成單個細胞的時候會形成許多細胞碎片，不宜上流式檢測，所以用于流式檢測的標本最好是新鮮標本，即取材后立即檢測，效果最好。 液氮保存的◆組織塊，可以將組織標本進行切片，然后做原位染色，觀察組織細胞的凋亡。
◆Annexin V可以用在植物和細菌中嗎？
Annexin V也可以用在植物和細菌中檢測凋亡，具體實驗步驟可參考相關文獻。
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